〔摘要〕　目的：用组织工程方法再造软骨。方法：分离、培养、扩传兔软骨细胞，接种于牛跟腱Ⅰ型胶原中形成软骨细胞/胶原凝胶复合物，倒置显微镜下观察细胞在凝胶中的生长情况。将复合物植入动物体内1、2月，观察软骨的再造情况。结果：软骨细胞在胶原凝胶中生长良好，植入体内1个月，形成软骨样组织，2个月时再造出成熟的软骨。结论：采用体外培养软骨细胞，接种于胶原凝胶中，是再造软骨组织的有效方法。
关键词　软骨；胶原；组织工程

　　软骨组织的自身修复能力很低，而且供区非常有限，因而各种原因所致的软骨缺损和畸形的治疗一直是一个临床难题。组织工程学是近年来发展起来的一门新学科, 是材料学、工程学和生命科学共同发展并相互融合的产物, 其最基本的思路是在体外分离、培养细胞, 将一定量的细胞接种到生物支架中, 通过细胞之间的相互粘附、生长繁殖、分泌细胞外基质, 从而形成具有一定结构和功能的组织或器官〔1〕。本研究将培养的软骨细胞接种于胶原凝胶中，对细胞在凝胶中的生长和软骨的形成情况进行了观察。

1　材料与方法
1.1　材料
　　新西兰兔（第四军医大学实验动物中心）,牛跟腱Ⅰ型胶原（陕西宝泰医用生物制品公司）。Ⅱ型胶原酶（Sigma）, DMEM培养液（Gibco）, 胎牛血清（浙江清湖犊牛利用研究所）。胰蛋白酶（Sigma）。
1.2　方法
1.2.1　兔耳软骨细胞的分离、培养　软骨细胞分离方法见参考文献〔2，3〕。将分离的软骨细胞用DMEM培养液（含体积分数为10%胎牛血清，青霉素，维生素C，谷氨酰胺）稀释至1×103/ ml，接种于75 ml细胞培养瓶内，每3 d换液一次，细胞长满后用2.5 g/L胰酶消化后，传代扩增〔2，3〕。
1.2.2　软骨细胞接种　取第二代软骨细胞，2.5 g/L胰酶消化后，1000 r/min离心3 min收集细胞，漂洗后计数，接种于4 ℃牛跟腱Ⅰ型胶原溶液中，使细胞终浓度为40×106/ ml，迅速用1 mol/L的NaOH将溶液的pH值调整为7.2左右，然后加入DMEM培养液使之成为胶原凝胶，倒置显微镜下观察细胞在胶原凝胶中的生长情况。培养5 d后，取一个复合物固定于福尔马林中，切片后HE染色观察细胞在胶原凝胶中的生长。
1.2.3　软骨细胞/胶原凝胶复合物的植入　软骨细胞/胶原凝胶复合物在体外培养5 d后，无菌条件下植入供体兔背部皮下组织中，分别于植入后1、2月取材，进行大体标本观察；福尔马林固定，切片后染色观察软骨的形成情况，并与正常兔耳软骨对照。

2　结　果
2.1　兔耳软骨细胞的分离、培养　消化后16 h，消化液内有大量小圆形细胞，接种于培养瓶内后24 h，细胞贴壁、伸展，为多边形和三角形，原代细胞7～10 d长满整个培养瓶。
2.2　软骨细胞在胶原凝胶中的生长　新形成的胶原凝胶为半透明状，软骨细胞呈球状分布于其中，24 h后细胞伸展成为梭形，并开始增殖，以后胶原凝胶不断收缩，其透明度也不断下降。切片后HE染色观察，软骨细胞在胶原凝胶中生长情况良好，并充分伸展。
2.3　软骨形成情况的观察　大体标本观察:软骨细胞/胶原凝胶复合物植入供体兔背部皮下组织中1月后，形成约0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm大小的结节，表面为纤维组织包裹，质地稍硬，无明显弹性；植入2月后形成的组织质地坚韧，富于弹性，切面为亮白色。组织学观察:1月标本内有大量合成功能旺盛的细胞，细胞外基质较少，其中可见散在的软骨岛，为软骨样组织，其中的胶原已被机体吸收(图1)；2月标本富于细胞外基质，HE染色被染成淡蓝色，其中可见大量软骨细胞位于陷窝中，细胞外基质番红 O染色强阳性，表明基质中富含糖胺多糖(图2)。

图1　植入1月时形成软骨样组织(HE，×40)

图2　植入2月时形成软骨组织，番红 O染色
强阳性(番红 O染色，×10)

3　讨　论
　　组织工程技术将生命科学和工程学原理相结合, 应用于恢复、保持、改善组织的功能, 为解决目前费用昂贵的器官、组织移植和再造问题提供了新的方法, 被认为是20世纪的十大技术之一。用该方法再造组织具有3个突出优点：(1)细胞可在体外培养及增殖，只需要极少量的自体组织，就可获得足够的细胞数量用于移植；(2)可以根据缺损的形状、大小、病变程度来设计三维支架的立体形状及吸收速度；(3)再造出的为生物性组织或器官〔1〕。Freed等〔4〕将软骨细胞接种于多孔聚乙醇酸支架上，修复兔膝关节软骨缺损，6个月时缺损完全修复。曹谊林首次再造出自然形态人外耳，使该技术进入了一个崭新的阶段〔5〕。

责任编辑：姚红祥