〔摘要〕　目的：观察松质骨基质-骨髓基质成骨细胞复合移植皮下成骨作用，以探索松质骨基质作为骨组织工程支架材料的可行性。方法：新生兔骨髓细胞体外培养、诱导后，接种于藻酸盐/松质骨基质中，形成松质骨基质/藻酸盐/骨髓基质成骨细胞复合物，并植入裸鼠背部皮下，对照组单纯植入松质骨基质。 植入4、8周后行X线摄片和组织学检查，观察骨形成情况。结果：松质骨基质/骨髓基质成骨细胞复合物皮下成骨效果明显优于松质骨基质。前者兼有纤维成骨和软骨成骨，以纤维成骨为主；后者仅见少量软骨成骨。结论：松质骨基质可以作为一种良好的骨组织工程支架材料。
关键词　骨基质；骨髓；成骨细胞

　　骨组织经盐酸脱矿处理形成 脱矿骨基质，移植后可以诱导未分化间充质细胞转化为成骨细胞而发挥骨诱导作用〔1〕，异体移植无明显免疫排斥反应〔2〕。国内外学者将它作为植骨材料进行了大量的实验和临床应用研究〔3〕。组织工程（tissue engineering）的研究进展为脱矿骨基质应用提供了新的思路，即体外分离培养自体细胞，细胞增殖分化后与脱矿骨基质复合，应用于临床修复工作。我们采用藻酸盐凝胶混匀-接种-固化技术，将骨髓基质成骨细胞与松质骨基质复合，植入裸鼠背部皮下，观察其异位成骨作用，并评价松质骨基质作为骨组织工程支架材料的可行性。

1　材料与方法
1.1　材料
　　DMEM培养液（Gibco），胎牛血清（浙江金华清湖犊牛利用研究所），胰蛋白酶（上海浦东生化试剂厂），CO2培养箱（美国），YJ-875型超净工作台（苏州净化设备厂），倒置显微镜（Olympus）,β-甘油磷酸钠（Sigma），地塞米松（Sigma），L-抗坏血酸（Sigma）。
1.2　方法
1.2.1　松质骨基质制备〔4〕　兔髂骨、膝关节取材，去净周围软组织、骨膜及表面软骨，预冷生理盐水冲洗骨髓腔，彻底去除残存骨髓和血块，2.5 g/L胰蛋白酶消化 30 min后，经反复冲洗，然后进行如下处理：(1)25 ℃,1∶1氯仿/甲醇1 h；(2)4 ℃，0.6 mol/L盐酸72 h；(3)4 ℃，2 mol/L氯化钙1 h；(4)4 ℃，0.5 mol/L EDTA 1 h；(5)4 ℃，8 mol/L氯化锂1 h；(6)55 ℃，水浴4 h。每步完成后，均以预冷蒸馏水漂洗3次，每次10 min。标本冻干，环氧乙烷消毒备用。
1.2.2　骨髓细胞分离培养　新生新西兰幼兔3只，断头处死，无菌条件下取髂骨、四肢长骨。剪碎，DMEM培养液冲洗，轻轻吹打，取上清以DMEM液（含体积分数10%胎牛血清）进行培养。24 h后换液，去除未贴壁的血细胞。第3 d换液，第5 d换诱导液（DMEM液，含β-甘油磷酸钠10 mmol/L，地塞米松10-7mol/L，抗坏血酸50 mg/L），使细胞向成骨细胞分化,形成骨髓基质成骨细胞(marrow stromal osteoblast)〔5〕。倒置显微镜下观察细胞生长情况。
1.2.3　骨髓基质成骨细胞接种　骨髓基质成骨细胞融合后以2.5 g/L胰酶消化，细胞计数。细胞与30 g/L海藻酸钠溶液混合（细胞终浓度5×107/ml，海藻酸钠终含量为10 g/L），充分混匀后接种到冻干松质骨基质上。待松质骨基质润湿膨胀充分后，滴加25 g/L氯化钙，使藻酸盐固化30 min，形成松质骨基质/藻酸盐/骨髓基质成骨细胞复合物。
1.2.4　实验动物及手术方法　选用裸鼠（BALB/C，雄性，5～6周，22 g）4只，自身对照。无菌条件下，切开裸鼠背部皮肤，潜行分离，于左右皮下分别植入复合物和松质骨基质（对照组）。每个动物每组植入2个标本，缝合皮肤。
1.2.5　观察方法　术后4、8周取材，进行以下观察。
　　(1)X线摄片　以X线牙片机行标本X线摄片，70 kV垂直投照，暴光时间0.30 s，球管距标本10 cm。
　　(2)组织学检查　取材标本大体观察后，甲酸/甲酸钠脱钙，脱水，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察新骨形成情况。

2　结　果
2.1　骨髓细胞培养情况
　　24 h骨髓细胞贴壁，细胞为短梭形、三角形或多角形。生长增殖迅速，7 d融合。

责任编辑：姚红祥