〔摘要〕　目的：对成骨细胞接种于天然珊瑚中的再造骨组织进行组织学观察。方法：体外分离、培养扩增兔成骨细胞，将细胞接种于多孔珊瑚中，然后植入兔背部皮下组织，术后4、8、12周取材，通过组织学、扫描电镜观察新骨的形成情况。结果：表明培养的兔成骨细胞可以在珊瑚表面良好生长，成骨细胞/珊瑚复合物植入皮下 4周，局部形成骨样组织，可见大量成骨细胞，胞浆丰富，某些部位可见红色的骨基质形成；8周时，形成大量新骨组织，但不成熟；12周时板层骨形成，扫描电镜观察见大量成骨细胞位于基质中。结论：用这种方法进行骨再造和骨缺损修复有很多优点，具有广阔的应用前景。
关键词　组织工程；成骨细胞；珊瑚

　　近年来学者们尝试用组织工程方法进行了生物性的人工软骨、骨、皮肤、心脏瓣膜、血管乃至人工肝、人工胰等的研制，取得了可喜的成果。其中软骨由于组织结构和细胞成分相对简单，研究进行得较为成功〔1〕。本研究采用天然珊瑚作为支架材料，接种成骨细胞后移植，对骨组织的形成情况进行了观察。

1　材料和方法
1.1　材料
　　滨珊瑚(海南三亚)，按张森林〔2〕介绍的方法进行处理。 同窝同性别新西兰幼兔 5只(第四军医大学动物中心), DMEM培养液（Gibco）, 胎牛血清（浙江清湖犊牛利用研究所）。胰蛋白酶（Sigma）。
1.2　方法
1.2.1　兔颅骨成骨细胞的培养　取 1只幼兔，按酶消化法进行颅骨成骨细胞的原代培养〔3〕，原代培养成功后，细胞进行扩增传代，获得大量细胞供移植用。其余动物作为珊瑚/成骨细胞移植的受体。
将多孔珊瑚制成直径8 mm、厚1 mm的盘状，蒸汽消毒后用培养液预湿备用。细胞用2.5 g/L胰酶消化，1000 r/min离心3 min，收集细胞，用培养液调整细胞浓度至 5×106/ml，每块材料上接种细胞液30 μl，放回 25 ml培养瓶中，细胞孵箱培养4 h后，加入4 ml培养液继续培养。
1.2.3　移植　接种细胞后 5 d取出材料，无菌条件下植入其余动物背部皮下。一块标本进行扫描电镜观察。
1.2.4　取材及观察　术后 4、 8、12周取材，甲酸 -甲酸钠脱钙液脱钙，常规石蜡切片，HE染色后观察。另取12周标本， 体积分数为3%戊二醛固定，乙腈系列脱水，临界点干燥，喷金，扫描电镜观察。

2　结　果
2.1　组织学检查　成骨细胞/珊瑚复合物植入后 4周，在皮下组织中复合物形成骨样组织，表现为大量的成骨细胞聚集，胞浆丰富，某些区域可以观察到红色的骨基质形成，但无板层结构，并能观察到成骨细胞位于陷窝内的典型的组织学表现，珊瑚表面已有吸收。植入后8周，在珊瑚表面和孔洞内均可观察到大量新骨形成，但不太成熟。12周时，骨组织变得成熟，珊瑚表面和孔洞中均有板层骨形成(图1)。

图1　植入12周时，珊瑚孔洞中有板层骨形成(HE, ×40)

2.2　扫描电镜观察　成骨细胞接种后 5 d， 细胞为多边形，贴附伸展良好，长满珊瑚表面和孔洞中(图2)，并开始合成细胞外基质；12周标本，材料的边缘已有吸收，珊瑚表面可见圆形成骨细胞位于束状排列的胶原基质中，孔洞中也可见大量的骨组织。

图2　成骨细胞接种后 5 d， 细胞长满珊瑚表面和孔洞(SEM, ×300)

3　讨　论
　　某些特殊部位的植骨有很高的要求，如眶底、眶下区、鼻背等，必须恢复适当的外形，才能获得满意的治疗效果。现有的各种生物性植骨材料，如自体骨、异体骨等，植入后要发生部分吸收〔4〕，复合BMP的植骨材料植入，新骨的外形也不可控制，因而均不能满足临床需要。用组织工程方法则有可能获得具有精确外形的骨组织，将成骨细胞接种到具有一定外形的支架材料上，等细胞长满材料表面后进行移植，将来形成新骨的形状就是支架的形状。
　　Kim等〔5〕将软骨细胞植入多孔的三角形、正方形、十字形的聚乙醇酸(PGA)中，成功地获得了三角形、正方形、十字形的软骨块，并进行了骨缺损修复的研究〔6〕，认为：这种方法为软骨移植提供了大量的组织来源，如果能辅以控释的生长因子、细胞因子，将有很大的发展前途，对骨科、整形外科、颌面外科等的发展会产生巨大的影响。

责任编辑：姚红祥