［摘要］　目的：建立基因转染兔舌肌和确定其最优化方案。方法：采用大规模提纯的pBlacZ质粒和普通医用外科缝线来制备分子外科缝线，通过手术切开兔舌肌，模拟临床操作，进行分子外科缝线术转染外源基因的试验，同时利用正交试验设计分析，选择与临床密切相关的因素进行基因转染最优化方案的研究。结果：基因转染实验侧含pBlacZ质粒的肌肉组织有lacZ基因的表达，正交试验分析提示在分子外科缝线术转染外源基因的研究中，4周、1/0缝线、经盐酸布比卡因麻醉可获得最高的基因表达效率。结论：兔舌肌可摄取和表达外源质粒,是—个潜在的分子外科转基因部位。
［关键词］　舌肌；　基因转染

　　《science》在1990年报告肌肉组织能有效吸收质粒DNA并表达相应的基因产物，开创了基因免疫的研究［1］。实现基因免疫的技术关键是基因导入真核细胞后的有效表达，特别是与临床有关的影响基因表达的因素，可通过正交试验设计来筛选确定。
　　本实验选择舌肌的原因是：1995年美国Johns Hopkins大学报告在口腔癌常规病理学检查切缘为阴性的部位中，有一半实际上已出现了P53基因突变，更重要的是P53突变处准确预测了肿瘤的复发部位，而舌癌治疗失败的一个重要原因正是局部复发［2］。

材料和方法

　　1. 质粒pBlacZ大规模提取纯化鉴定
　　将含有重组质粒pBlacZ的大肠杆菌JM101的单菌落接种入500ml三角瓶中的含200mlLB培养基中的（含100μg/ml氨苄青霉素），加入1ml溶液I(15%蔗糖,25mmol/L Tris-HCI,10mmol/L EDTA,pH8.0)，溶液II(0.2N NaOH,10%SDS)，溶液Ⅲ(3M NaAc)，加入0.6倍体积的异丙醇，用苯酚：氯仿：异戍醇（25∶24∶1）抽提两次，再用氯仿：异戍醇抽提一次。将DNA溶于100μlTE缓冲液中，-20℃贮存，用紫外分光光度法检测质粒DNA纯度及浓度，琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA分子量大小。取限制性内切酶SstI和HindⅢ，1%琼脂糖凝胶电泳分析DNA，0.5×TBE缓冲液，60V电压，电泳1h，EB染色30min,将提纯的pBlacZ质粒（OD260／OD280在1.8－2.0之间）按1ug/ul溶于PBS缓冲液中（含5％庶糖，pH7.4）
　　2. 制备分子外科缝线
　　将普通医用外科缝线在无菌条件下将1cm长的各段放入含pBlacZ质粒的PBS缓冲液中浸泡过夜，同时设立对照组，即放入不含pBlacZ质粒的PBS缓冲液中,次日在超净工作台上吹干缝线，放于无菌Eppendorf管中备用。
　　3. 制备实验动物模型
　　出生5个月的日本大耳白兔（湖北医科大学实验动物中心提供）, 大白兔采用3%戍巴比妥钠沿耳缘静脉按1.0ml/kg注射麻醉，根据情况,术中追加麻醉。
　　4. 兔舌左右侧对照和正交试验设计方案
　　正交试验设计包含3个因素2个水平(见表1)，可按L827正交表设计实施。同时在大白兔舌左侧设立实验组，舌右侧设立对照组。

表1　三因素两水平正交设计试验表

水平	时间	缝线型号	术前处理
1	1周	5／0	25％蔗糖
2	4周	1／0	0.5％盐酸布比卡因

 

　　5. 动物试验手术步骤
　　静脉麻醉大白兔后，手术区部位消毒，铺巾, 根据正交表设计安排，术前6h分别在舌左侧或右侧注射25%蔗糖或0.5%盐酸布比卡因, 用10号手术刀在舌侧缘中份作长约1.5cm，深约1cm的切口，通过预试验已获知此时出血将十分凶猛，故须手术助手在切口附近及舌根部压迫止血,立刻将准备好的分子外科缝线用外科血管钳放入切口内，注意放平和放直, 快速缝合手术创口以止血，同时作好标记,舌侧缘手术创口处涂抹红汞，同时腹腔注射庆大霉素和地塞米松以预防术后伤口感染,术后必须密切观察大白兔伤口变化和进食情况，加强抗炎治疗。
　　6. lacZ 基因在舌肌组织中表达的检测
　　根据正交表试验安排，分别在第1周或第4周处死大白兔，按标记切取含有分子外科缝线的舌肌组织, 立刻送往病理室作冰冻切片,切片以1.25% 戍二醛固定10min，吹干，注意勿使冰冻切片之间相互贴附,冰冻切片置x-gal染色液中于37℃温育染色48h,各级酒精脱水、二甲苯透明、树脂封片，镜下观察并拍照。

责任编辑：姚红祥