［摘要］　目的：探讨猕猴耳廓软骨细胞在体外不同介质的培养情况及其生长活性。材料与方法：对6只猕猴进行耳廓软骨取材、软骨细胞的分离，并行单层贴壁培养及在人工基质上的培养。通过倒置显微境和扫描电镜观察不同方式培养的细胞生长情况。结果：单层贴壁培养的软骨细胞可传代5～6代，但第三代软骨细胞分泌的Ⅰ型与Ⅱ型胶原的能力无明显差别；在几丁质上培养的软骨细胞能保持体内细胞的正常形态；在VICRYL上培养的软骨细胞能分泌软骨基质。结论：不同的体外培养方式下软骨细胞的生长活性略有不同，需根据不同的实验要求选择相应的培养方式。
［关键词］　猕猴；　耳廓软骨；　细胞培养；　人工基质

　　细胞生存环境不同所表现的生物学特性有所差别。而软骨细胞的培养是组织工程化软骨最基础的步骤。不同的培养方式获得的软骨细胞经移植后形成的软骨成分有差异［1］。因此有必要对体外培养的软骨细胞进行不同培养方式的研究。本实验对猕猴耳廓软骨细胞进行了单层培养和在立体人工基质上培养的研究，探讨猕猴耳廓软骨细胞在体外不同介质的培养情况及其生长活性。

材料与方法

　　一、实验动物
　　猕猴6只，5～8岁(青年猕猴)，雄性，体重6～8kg。由上海西普尔动物实验中心提供。
　　二、方法
　　1. 软骨细胞悬液的制备
　　无菌条件下通过背侧进路获取猕猴一侧的耳甲软骨。将取下的耳甲软骨表面的软骨膜剥离，剪成2mm×2mm大小碎片，磷酸盐缓冲液(PBS，含青、链霉素各100u/ml)冲洗3遍，加入3倍体积的0.25%胰蛋白酶(Sigma,USA)，置于37℃恒温振荡器(精华THZ-95型，江苏)内消化1h；取出标本，弃去胰蛋白酶液体，加入含血清的培养液中止胰蛋白酶消化；然后再加入3倍体积的0.1%Ⅱ型胶原酶(Sigma,USA)，再置于37℃恒温摇床内消化8～12h。见大部分软骨块被消化后，以200目尼龙网筛过滤，收集消化液，1000r/min离心5min使细胞沉淀。沉淀细胞以PBS洗3次，以洗去细胞表面的消化酶。加入Ham'F-12培养液制成细胞液(Gibco,Gland Island,USA)，含10%胎牛血清，L-谷氨酰胺300μg/ml,维生素C 50μg/ml,青、链霉素各100u/ml。台盼蓝染色计数。
　　2. 软骨细胞的培养与观察
　　(1)单层贴壁培养：将记数后的细胞移入25ml培养瓶中，每瓶接种细胞约5×105个，加入Ham'F-12培养液中，置于37℃、饱和湿度、5%CO2细胞孵箱(Forma Scientific,USA)内培养，每2天换液1次，倒置显微镜(Olympus)下观察并照相，细胞长满后用0.25%胰蛋白酶传代。
　　将生长良好的第三代软骨细胞接种于玻璃片上，长满后取出，PBS冲洗，95%酒精固定：苏木精-伊红(HE)染色；ABC法进行Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组化染色(Ⅰ、Ⅱ型胶原鼠抗人抗体，Neomarker,USA)。
　　(2)加入人工基质培养：将消毒完毕的几丁质(直径15μm纤细，间隔150～200μm，厚度100μm，无纺网，由东华大学提供)和VICRYL(Polyglactin 910)可吸收膜(Ethicon,USA)剪成5mm×10mm大小，置入96孔培养板。每孔加入5×106细胞悬液200μl，37℃孵箱内放置4h后，每孔加入Ham'F-12培养液1ml,再置入37℃孵箱内培养。培养液每3d更换1次，倒置显微镜下观察并照相。
　　将VICRYL上培养1周的细胞立即用3%戊二醛固定，1%锇酸后固定，0.1M PBS冲洗后，乙醇梯度浓度逐级脱水，醋酸异戊酯置换，液体CO2临界点干燥，真空离子镀膜，JEOL-840扫描电镜观察。

结　果

　　单层贴壁培养的软骨细胞于接种后12h开始贴壁，24～36h完成贴壁变形。其外形为多边形，胞浆丰富，胞核清晰，有1～2个核仁，细胞长成一片可呈明显的铺路石状外观。经过本方法消化发现培养后仅见单一的软骨细胞生长。细胞传至6～7代后，体积开始变大，出现指状突起，核变大，核仁增多，增殖速度减慢。HE染色见胞核呈蓝紫色，胞浆淡红色(图1)。Ⅰ、Ⅱ胶原免疫组化染色见软骨细胞胞浆染成棕黄色，胞核不着色，Ⅰ、Ⅱ型胶原染色灰度无明显差异。

责任编辑：姚红祥