几丁质上培养的细胞在倒置显微镜下成球形或类球状，粘附于网状的纤维上，呈“树上结果”样(图2)。
　　VICRYL膜上培养的细胞在倒置显微镜下呈现类似贴壁状，但具扁平的立体形态。电镜观察发现培养1周后的软骨细胞在呈编织状的VICRYL(图3)上粘附生长，呈多边形，分泌的基质呈伪足样缠绕在VICRYL支架表面。

图1　培养软骨细胞HE染色(×40)

图2　几丁质上培养的软骨细胞

图3　VICRYL 膜上培养的软骨细胞(SEM，×100)

讨　论

　　正常组织细胞的增殖是有限的。单层培养的软骨细胞只能传5代，因为传代过程会造成细胞的反分化［2，3］。我们观察到软骨细胞传至6～7代后呈现明显增殖缓慢及衰老现象。软骨细胞在体内分泌多种胶原。其中Ⅱ型胶原的含量最高。研究表明单层贴壁培养的细胞在培养后5～6d即可发生反分化。即使在高密度培养下，当软骨细胞传至第3代时，细胞亦出现反分化，其分泌Ⅱ型胶原的能力下降［4］。本实验发现体外培养的软骨细胞具备分泌胶原的能力，但其Ⅰ、Ⅱ型胶原染色无显著性差异，证实了在单层培养中，软骨细胞形成软骨基质的能力逐渐下降，这也是细胞反分化的结果。但对单层培养而去分化的软骨细胞，应用低熔点的琼脂糖进行培养，可促使细胞从合成Ⅰ型胶原转变为合成Ⅱ型胶原，即软骨细胞出现再分化的现象［5］。
　　传统的细胞培养方法和培养系统，很难满足立体组织器官的细胞生长所需的高标准环境需求，因此出现了在三维结构支架上的立体细胞培养，并证实这种培养方法能明显促进软骨细胞合成Ⅱ型胶原基质。我们尝试了在几丁质上进行细胞培养。几丁质是一种疏松的无纺网结构，软骨细胞在其上生长呈圆形或类圆形，明显区别于贴壁培养的细胞形态，而与体内正常细胞形态接近。可降解人工生物材料VICRYL是聚羟基乙酸(PGA)和聚乳酸(PLA)的聚合物，在其上的细胞培养也证实了软骨细胞能为PGLA支架粘附，并在其上生长，分泌软骨基质。
　　然而天然机体细胞都是处于机体提供的动力环境中生长的，组织工程的细胞培养需要模拟体内组织生长所处的微环境动力学特征，既做到立体细胞培养，维持细胞正常形态和功能表达，又能通过动态流体环境，使营养成分均匀扩散进入整个细胞支架三维共聚体中，使细胞能获得生长所必须的充分营养成分。根据这些设想和要求，研究者已构建了多种提供动力微环境的培养系统。如，模拟微重力旋转生物反应器(Simulated Microgravity in Rotating Bioreactors)系统、固体转动生物反应器(Solid Body Rotation in Rotating Bioreactors)系统、搅动混合旋转培养瓶(Turbulent Mixing in Spinner Flasks)系统、环绕混合培养皿(Orbital Mixing in Petri Dishes)系统。Gooch KJ等［6］研究了在搅动混合旋转培养瓶系统中不同的混合强度对软骨细胞的生长效应，结果在该系统培养形成的软骨含有较多的胶原成分。Sittinger M等［7］发明的灌注培养系统能恒定提供细胞所需的各种养分，在长期培养过程中能保持培养基pH值和葡萄糖浓度的稳定，用于三维生物材料聚合物-细胞的培养试验显示出较好的效果，能为组织工程器官组织提供可靠的培养环境。此外，通过模拟机体环境中软骨细胞所处的动态负载环境，给体外的三维培养体系加以动态的负载，如间断性加压负载，可促进体外软骨细胞的细胞基质合成［8］。
　　综上所述，不同培养方式的软骨细胞表现出不同的生长活性，单层培养的细胞易出现去分化现象，难以满足组织工程技术的需要，而解决细胞出现反分化的现象可能需要更先进的体外培养方式。

［作者简介］张金宁(1963-)，男，上海人，主治医师，硕士。主要研究方向：牙髓病、根尖周病。
张金宁(上海第二医科大学口腔医学院，　上海　200011)
王旭东(上海第二医科大学口腔医学院，　上海　200011)
杨驰(上海第二医科大学口腔医学院，　上海　200011)

责任编辑：姚红祥