摘　要：目的：研究不同培养条件对骨骼肌细胞增殖及分化的影响。方法：以体外培养小鼠肌母细胞C2 C12为研究模型，对照组用含φ=10%胎牛血清液培养，实验组培养基改变为φ=2%胎牛血清的DMEM液，分别于更换培养液后24、48、72 h，观察细胞形态变化。结果：对照组细胞形态实验前后无变化，实验组24、48 h时部分细胞出现死亡，72 h存活细胞开始融合，肌管形成。结论：胎牛血清含量为φ=2%的DMEM液有促进肌母细胞分化，从而进一步形成肌管的作用；含φ=10%的DMEM不能使之分化，提示不同血清含量的DMEM培养基对体外培养的骨骼肌细胞的增殖和分化有重要影响。
关键词：骨骼肌；肌细胞；分化

　　生物体都能对外界信号发生反应，其中很多是以含量的变化这一形式传给细胞，如激素、生长因子、神经调节因子及其它分子。肌肉细胞的发育成熟和分化等各个阶段也均受到各种因子网络调节的影响，需要很多营养成分。一般认为已经发育成熟的肌肉不具有再生能力，肌卫星细胞发现以来，随着对其研究的不断深入，人们逐渐认识φ=10%的DMEM不能使之分化，提示不同血清含量的DMEM培养基对体外培养的骨骼肌细胞的增殖和分化有重要影响。

1　材料与方法
1.1　细胞培养
　　C2C12细胞（Proton教授惠赠），2.5g/L胰蛋白酶消化,吸管吹打,制成细胞悬液,以细胞数1× 109/L密度接种于培养瓶 或35mm直径培养皿内,分别用含体积分数(φ)10%或2%胎牛血清的DMEM培养(部分皿内有盖玻片,为染色用)随后置于孵育臬培养(φ=CO2),    至对数生长期进行实验。
1.2　实验分组
　　取培养至对数生长期细胞的培养瓶随机分为对照级和实验组。对照组含φ=10%胎牛血清DMEM液，实验组培养基忙乱变为φ=2%胎牛清DMEM液，分别于更换培养液后24、48、72h用倒置显微镜观察细胞的形态变化、照相。两组实验平行进行。
1.3　台盼兰排斥实验
　　制备单细胞悬液，稀释至细胞数1×10/L，取9滴细胞悬液移入小试管中，加1滴5g/L台盼兰溶液，浸染3min，在倒置显微镜下分别计数500个相邻的活细胞和死细胞。根据公式：活细胞率=
活细胞总数＝计算细胞活力，
每组均重复计数5次。
1.4　统计处理
　　按Student t检验。

2　结果

2.1　图1示实验组和对照组的C2C12细胞形态上出现明显差异。对照组中骨骼肌肌母细胞继续增殖，形态为长梭形，星形，细胞核位于中央，大小均一，实验前后形态无改变，数量明显增加。实验组在含φ=2%胚胎牛血清的DMEM培养基培养24 h后，镜下见有的细胞变圆皱缩，出现中毒颗粒，部分细胞开始出现凋亡或死亡，存活细胞相互连接成网，细胞形态未见明显变化，至72 h后存活肌母细胞形态发生明显改变，细胞开始融合，出现多核肌管。肌管体积为单个肌母细胞3～5倍，核有3～9个不等，最多可达15个。肌管之间相互连接成长条，形成网状。φ=2%的培养基培养至1月后出现了肌肉短暂的收缩现象。

图1　C2 C12细胞在φ=10%血清DMEM培养(A)在φ=2%血清DMEM培养24 h(B)、48 h(C)、72 h(D) 时光镜图像(×100)

2.2　台盼蓝染色显示，对照组在继续培养24、48、72 h后，活细胞率各数值之间统计差别都不明显。而实验组在培养24、48 h活细胞与同时期的对照组相比，差别非常显著（P<0.01），其中48 h 时细胞活力最差，细胞死亡在48 h内达到高峰（约20%～30%）。以后细胞死亡逐渐减少，72 h时活细胞率无明显差别（表1）。

 表1　血清含量对骨骼肌细胞活力的影响　　　（±s）%

　　n=5同时期两组比较 ①P<0.01
3　讨　论

　　C2 C12小鼠肌母细胞在φ=10%胎牛血清DMEM培养液中不断增殖，表现在数量增加，而细胞的形态不发生改变。培养条件的改变，即将DMEM培养液中血清含量由10%减少至2%，细胞变化非常显著。表现在数量上：24 h后部分细胞出现凋亡或死亡（凋亡的检测另有文章阐述），活细胞率下降；形态上：约70%～80%的鼠肌母细胞开始出现分化现象，肌母细胞离开初始的细胞周期，而进入细胞分化阶段，细胞开始融合，形成多核肌管。实验组24 h和48 h时与对照组活细胞比率差异明显，可见外部培养条件改变，鼠肌母细胞经历了一系列变化，刺激肌母细胞特异性基因开放，表达特异性蛋白，而这一过程尤以环境改变后的24 h和48 h为显著，72 h后细胞逐渐生长趋于稳定，这种过程是不可逆的。

责任编辑：姚红祥