HMGB1在牙周炎中作用研究进展

    牙周炎是一种导致牙齿支持组织（牙骨质、牙周膜和牙槽骨）进行性破坏的慢性炎症。从全球的状况来看，大约有11%的世界人口可能患有严重的牙周炎，影响到7.43 亿人。牙周炎的主要临床表现为牙龈出血，临床附着丧失（CAL），牙周袋形成，牙槽骨吸收。
    它以牙菌斑为始动因子，由宿主免疫炎症反应、遗传和环境等多种因素造成。然而，牙周炎的病理机制尚未完全明确。近年来，诸多研究证实：高迁移率族蛋白B1 （high mobility group B1，HMGB1）在牙周炎病理过程中同时具有促进炎症及组织再生的双重作用，并参与伴吸烟、糖尿病牙周炎的发生发展。
    HMGB1 作为真核细胞中高度保守的、广泛表达的非组蛋白核蛋白，在炎症及感染刺激下可由坏死、受损细胞被动释放或免疫细胞主动分泌至胞外。HMGB1 作用于靶细胞表面Toll 样受体（toll-like receptors，TLRs）和晚期糖基化终末产物受体（receptor of advanced glycation end-product，RAGE），释放损伤信号，参与炎症和免疫反应，还可刺激细胞增殖及分化，启动组织修复及再生。
    HMGB1 的复杂生物学功能与其分子结构与定位、氧化还原状态、分泌途径、受体等相关。本文就HMGB1 在牙周炎作用的最新研究进展做一综述。
    1.HMGB1 的生物学特性
    1）HMGB1 的结构：HMGB1 含有两个以三个α螺旋和两个环以“L”形排列的近端同源DNA 结合结构域，称为A-box（9-79aa）和B-box（95-163aa），一个带有重复的谷氨酸和天冬氨酸的C-末端酸性尾（186-215aa），以及一个短但具有重要功能的N末端结构域。B-box 具有促炎活性，而A-box 为HMGB1 拮抗剂，能竞争性与B-box 结合，发挥抗炎修复作用，与C-末端酸尾融合后，A-box 的抗炎活性进一步增强。
    细胞核中，HMGB1 参与核小体及染色体稳定与维持、基因转录及损伤修复、端粒酶的功能及活性。HMGB1 在细胞核中的稳定定位是与两个核定位信号（nuclear localization signals，NLSs）有关：NLS1（28-44aa）和NLS2（179-185aa）。NES 和NLSs 的表观遗传修饰介导了HMGB1 亚细胞位置及功能改变。
    2）HMGB1 的胞质转运：HMGB1 的胞质转运和功能与翻译后表观遗传修饰密切相关，其中最重要的是可逆性乙酰化修饰。HMGB1 对DNA 的亲和力取决于NLS1 及NLS2 的乙酰化程度。缺氧、缺血、细胞因子、感染等氧化应激可诱导NLSs 赖氨酸残基突变为谷氨酰胺，促进HMGB1 的核胞质转运和分泌。
    此外，Lys42 甲基化修饰可改变HMGB1 蛋白构象，降低其DNA结合活性；C-末端酸性尾的ADP核糖化促进HMGB1 的分泌；发生于N37、N134、N135N-糖基化修饰，减弱HMGB1 与DNA 的结合，促进HMGB1 的释放。
    目前普遍认为，HMGB1 的氧化还原修饰与其炎症促进或者组织修复功能密切相关。HMGB1 的第23、45 和106 位半胱氨酸对氧化还原敏感，可产生三种异构体：完全还原型HMGB1，二硫化型HMGB1 和磺酰型HMGB1。完全还原HMGB1 在C23 和C45 之间形成二硫化键C23-S-S-C45，被氧化为二硫化型HMGB1，位于具有促炎活性B-box 的硫醇C106 通过TLR4/髓系分化因子2（myeloid differentiation factor-2，MD-2）复合体及RAGE 诱导促炎细胞因子的产生，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）等，从而发挥促炎作用。
    目前，不同氧化还原状态HMGB1 在体内的分布尚不完全明确。生理情况下，完全还原型HMGB1存在于细胞核中，再生肌纤维细胞核中高表达完全还原型HMGB1。然而，HMGB1 氧化可发生在小鼠骨髓来源巨噬细胞、小鼠胚胎成纤维细胞和HEK293 细胞核中，由细胞中高表达的抗氧化酶家族过氧化物还原蛋白（peroxiredoxins，Prxs）介导形成二硫键，是HMGB1 核质易位和分泌所必需的。Michele 等也证实健康人白细胞裂解液中检测出高表达二硫化型HMGB1。
    3）HMGB1 的释放：由于缺乏前导信号序列，HMGB1 不能通过经典的内质网-高尔基体途径分泌。感染或炎症状态下，HMGB1 可由坏死细胞、靶细胞程序性、促炎性的细胞凋亡、细胞焦亡释放，或进入细胞质的HMGB1 被包装到细胞内囊泡，如溶酶体或自噬体中，囊泡与细胞质膜融合后通过胞吐作用主动释放。
    此外，HMGB1 还可以外泌体的形式释放。脂多糖（Lipopolysaccharide， LPS）结合肝细胞表面TLR4，导致含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶11（cysteinyl aspartate specific proteinase-11，caspase-11）的表达增加，并裂解焦孔素（gasderminD，GSDMD），引起内质网内Ca 离子流增加，激活磷酸化钙调素激酶B 使HMGB1 以外泌体的形式释放。
    胞外HMGB1 可与多种细胞外受体结合，例如RAGE、TLR4、α-突触核蛋白丝等，目前证据比较充分的受体为TLR4 及RAGE。HMGB1 通过特定结构域与受体相互作用：TLR4 结合位点位于HMGB1 序列89-108aa，RAGE 结合位点位于23-50aa 及150-183aa。
    2.HMGB1 在牙周炎中的作用
    1）HMGB1 对慢性牙周炎致病的作用：致病菌及其代谢产物引起过度的宿主免疫炎症反应是造成慢性牙周炎的主要原因。在牙周微环境中，HMGB1 表现为双重作用：加重炎症反应、促进组织修复。多项临床研究证实：慢性牙周炎患者龈沟液（gingival crevicular fluid，GCF）及血清中HMGB1高表达，且牙周基础治疗后HMGB1 表达降低，HMGB1 水平与菌斑指数、出血指数、牙周袋深度、附着丧失正相关。
    此外，实验性牙周炎动物牙周组织免疫组化分析发现：HMGB1 在牙龈、牙周膜、根分叉区及下颌骨中表达均显著升高。慢性牙周炎患者牙龈组织中HMGB1 主要表达在沟内上皮基底层、固有层炎性浸润细胞及成纤维细胞中，牙槽骨中成骨细胞表达多于破骨细胞，在细胞质中表达均显著高于细胞核。此外，TLR2、TLR4、RAGE 在慢性牙周炎患者牙龈组织表达显著高于健康对照组。
    牙龈卟啉单胞菌（porphyromonas gingivalis，Pg）是慢性牙周炎病变区或活动部位最主要的优势菌，其毒力因子参与逃避宿主免疫防御机制，破坏牙周组织。其中，Pg-LPS 是TLR4 及RAGE 的有效配体，Pg 脂蛋白可作为TLR2 配体，均可激活NF-κB 通路，释放HMGB1、TNF-α、IL-1β 等促炎因子。
    牙龈卟啉单胞菌浸润的结扎线诱导小鼠实验性牙周炎模型，免疫荧光分析发现，牙龈上皮细胞中HMGB1从细胞核移位至细胞外，促进IL-1β 和C-X-C 基序趋化因子配体1（C-X-C motif chemokine ligand1，CXCL1）表达、中性粒细胞迁移和牙槽骨吸收，全身给药抗HMGB1 抗体的可显著抑制HMGB1 的易位，抑制牙周炎症。
    2）HMGB1 对糖尿病牙周炎致病的作用：糖尿病是牙周炎的系统性危险因素，糖尿病患者牙周炎发病率是非糖尿病人的2～3 倍，表现为更严重的炎症反应，且依靠局部治疗难以控制的牙周组织破坏。糖尿病牙周炎的发病机制尚不明确。高血糖促进牙周组织中HMGB1、RAGE 表达增加，体外构建伴糖尿病牙周炎小鼠模型，免疫组化研究结果发现，HMGB1、RAGE 在糖尿病牙周炎牙龈组织中表达均显著高于牙周炎组。该结果提示HMGB1、RAGE 参与了糖尿病牙周炎的发展。
    高血糖可通过HMGB1/RAGE 信号轴持续激活NF-κB信号通路，释放IL-6、TNF-α，加重糖尿病牙周炎病理过程。持续的高糖环境能够诱发炎症反应的发生并引起氧化应激水平增高，HMGB1 是一种重要的炎性介质。
    二甲双胍是Ⅱ型糖尿病的一线用药，也是HMGB1 的抑制剂之一，其可直接结合HMGB1 并抑制其促炎活性。二甲双胍和盐酸二甲双胍负载聚乳酸-乙醇酸纳米颗粒可减轻大鼠牙周炎症反应和骨吸收，这表明二甲双胍不仅可以降低血糖水平，还有阻断HMGB1 的抗炎作用，可能对糖尿病牙周炎有效。
    研究表明，高糖培养基培养牙龈上皮细胞，与对照组比较，HMGB1、RAGE、氧化应激指示剂8-OHdG 表达增加，抗氧化酶SOD 表达降低，毛蕊花苷通过抑制PKC/HMGB1/RAGE/NF-κB 信号通路，促进SOD 表达，抑制8-OHdG 的表达，并上调PGC1-α 和NRF1，促进线粒体的生物发生，降低氧化应激水平。HMGB1 在糖尿病和牙周炎之间的双向关系中起到了重要作用。
    3）HMGB1 对伴吸烟牙周炎的作用：在环境因素中，吸烟作为独立危险因素导致慢性牙周炎加重已经成为共识，有研究发现，吸烟者患牙周炎的可能性高，是非吸烟者的4 倍，且牙周病情重，有更严重的牙槽骨吸收，更深的牙周袋，而且治疗效果差，但牙龈探诊出血程度却比不吸烟者轻，且戒烟后牙龈出血反而加重。
    有实验收集了伴吸烟慢性牙周炎患者、非吸烟慢性牙周炎患者和非吸烟牙周健康者的龈沟液样本。ELISA 分析HMGB1 的水平发现，非吸烟慢性牙周炎患者龈沟液HMGB1 中值水平显著高于伴吸烟慢性牙周炎患者和非吸烟牙周健康者，且伴吸烟慢性牙周炎患者和非吸烟牙周健康者间没有显著差异。
    尼古丁抑制LPS 诱导的巨噬细胞中HMGB1 胞质易位，保留其核定位，表明尼古丁抑制HMGB1 释放到细胞外。孙立众等对比吸烟及非吸烟慢性牙周炎患者的牙龈组织中HMGB1 的表达水平，结果显示，HMGB1mRNA 在牙周炎组及健康对照组中，吸烟者表达均高于不吸烟者，且以吸烟牙周炎组的表达水平最高。因此我们推测，吸烟及炎症使HMGB1 的基因水平表达增加，而烟草中成分抑制其核移位。目前吸烟对于牙周炎中HMGB1 的影响仍存在争议。需进一步实验证实吸烟通过何种特殊病理机制加重牙周炎症，同时导致HMGB1 表达异常。
    3.HMGB1 与牙周组织再生
    牙周组织包括牙槽骨、牙周韧带和牙骨质。牙周感染刺激HMGB1 的释放，进而促进炎症因子的分泌，导致牙龈出血，临床附着丧失，牙周袋形成，牙槽骨吸收等。释放的炎症因子进一步促进HMGB1的分泌，引起炎症的级联放大反应，加重牙周炎症及牙槽骨的吸收。
    生理情况下，HMGB1 在大鼠下颌骨中破骨细胞表达较成骨细胞多，主要位于细胞质及细胞核中，牙龈卟啉单胞菌诱导牙周炎下颌骨组织中，成骨细胞表达多于破骨细胞，与对照组相比，2～6 周内HMGB1 在成骨细胞表达均升高，破骨细胞中2、3周HMGB1 高于正常组。HMGB1 在骨折血肿区域高表达，可促进间充质干细胞（MSCs）成骨分化，成骨细胞增殖及迁移，以及相关细胞因子的释放，促进骨折愈合。
    牙周膜成纤维细胞的持续增殖、定向迁移和功能分化，是实现牙周组织再生修复的关键。Wolf 等研究证实，HMGB1 促进牙周膜成纤维细胞增殖、迁移，促进其碱性磷酸酶（ALP）、血清骨桥蛋白（OPN）、骨钙素（osteocalcin， OC）、Runt 相关转录因子2（Runx2）、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein， BMP）的表达及矿化结节的形成，从而促进成骨分化。
    此外，HMGB1 作为趋化因子对间充质干细胞具有趋化性。抗体阵列分析研究发现HMGB1 作用于人骨髓间充质干细胞后，表皮生长因子受体（epidermal growth factor Receptor，EGFR）的表达上调，并激活下游Ras/MAPK 信号通路，促进其成骨分化。TLR2、TLR4 及RAGE 在牙周组织再生中具有重要意义。rHMGB1 能显著促进成骨细胞的迁移而不抑制其增殖。靶向构建TLR2 或TLR4特异性siRNA 可以显著抑制HMGB1 诱导的成骨细胞迁移。
    除此以外，HMGB1/RAGE 信号在口腔组织修复中也发挥重要作用。体外培养RAGE-/-牙龈成纤维细胞发现其增殖、迁移在再上皮化进程中被延迟。Biguettiet 等报道，HMGB1/RAGE 信号参与干细胞迁移，巨噬细胞M1/M2 极化和纯钛种植体成骨过程骨整合，抑制HMGB1 或RAGE 可促进巨噬细胞迁移并向M1 极化，影响骨沉积及骨基质成熟。此外，HMGB1 可通过TLR2、TLR4 和RAGE 介导内皮细胞激活、血管生成。据此我们推测，HMGB1 可能在牙周组织再生中起促进作用。
    4.阻断HMGB1 对牙周炎的治疗作用
    多项临床研究证实：牙周炎患者龈沟液（gingival crevicular fluid，GCF）及血清中HMGB1 高表达，且牙周基础治疗后HMGB1 表达降低，HMGB1 水平与菌斑指数、出血指数、牙周袋深度、附着丧失正相关。有大量研究表明，应用HMGB1 阻断剂对牙周炎有抑制作用。
    甘草酸作为一种天然的三萜糖缀合物，天然分子甘草甜素是甘草根的一种成分，也已被测试以阻断HMGB-1 效应，因为它直接与HMGB-1 结合，阻止其与配体受体的相互作用。其广泛应用于牙膏等口腔清洁用品中，Takeuchi -Hatanaka 等通过随机双盲临床试验证实含有甘草酸的清洁用品可有效控制口腔炎症。
    Ideguchi 等通过组织学分析，牙周炎小鼠骨表面有大量的破骨细胞，骨表面有吸收腔，牙周组织有嗜中性粒细胞浸润。甘草酸不仅能显著降低破骨细胞的数量，而且还能显著降低中性粒细胞的数量，说明甘草酸对牙周炎的发生有抑制作用。有研究发现甘草酸可以抑制HMGB1 的释放，从而保护造影剂损伤的HK-2细胞。由此我们可以推断，甘草酸有可能是通过抑制HMGB1 的释放从而控制牙周炎的进展。
    抗HMGB1 抗体是最有效的HMGB1 抑制剂之一，有研究表明，抗HMGB1 抗体可以减弱GM-CSF、IL-1β等细胞因子的分泌，阻止了破骨细胞的长时间免疫刺激和骨吸收活性，从而抑制牙周炎的进展。咬合创伤是牙周炎重要的局部促进因素，Mika 等人在小鼠左下第一磨牙上制作咬合创伤模型，免疫组化研究证实：根分叉区骨吸收和破骨细胞形成逐渐增加，HMGB1、TLR4 和核因子κB 受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factors -κB ligand，RANKL）表达均增加。注射抗HMGB1 中和抗体，显著减少分叉区破骨细胞的数量以及RANKL 和TLR4 的表达。
    牙周致病菌释放毒性产物作用于宿主免疫防御系统，直接或间接促进HMGB1 的释放，释放的HMGB1 作用于邻近细胞表面TLR2/4 及RAGE，产生促炎因子及趋化因子，如IL-8 及GM-CSF，迁移并分化免疫细胞，诱导其分泌促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 及HMGB1，放大局部炎症反应，加重的炎症反应进一步促进破骨细胞的生成及牙槽骨的吸收。吸烟、糖尿病作为牙周炎的独立危险因素，参与HMGB1 介导的牙周组织破坏。此外，HMGB1 可促进牙周膜成纤维细胞迁移及成骨、促进内皮细胞活化及血管再生。
    虽然关于HMGB1 在牙周炎中双重作用已有诸多研究，但其调控牙周炎免疫炎症反应及牙周再生具体分子机制尚不完全明确。HMGB1 的不同结构域、不同氧化还原形式、分泌机制、刺激类型（有菌、无菌）如何通过相关细胞间信号转导及其生物学效应参与牙周炎的发生及发展，将是未来研究的重点。