类金钢石碳—钛复合体的生物相容性评价—NK细胞活性和IL-2产生能力测定
|
|
【摘要】目的：检测类金钢石碳—钛复合体（diamond－like－carbon titanium,DLC－Ti）对机体NK细胞(自然杀伤细胞，natural killer cell)活性和IL－2(白细胞介素Ⅱ，intereukins Ⅱ)产生能力的影响。方法：将DLC－Ti、纯钛、医用不锈钢、纯铜4种材料植入小鼠体内，分别于1、2、4和6周后检测NK细胞活性和IL－2产生能力。结果：DLC－Ti在术后第4周使NK细胞活性和IL－2产生能力降低明显（P<0.01），至第6周时已基本恢复正常。而纯钛对两项指标的影响都比DLC－Ti明显，NK细胞活性在实验后期仍受到明显抑制。结论：DLC－Ti具有比纯钛更好的生物相容性。
近几年有不少国外研究者对类金钢石碳(DLC)这种近代研制出的优异的涂层材料寄以很大希望而多方进行研究[1,2]。我们已经对DLC－Ti的生物相容性进行了细胞毒性评价[3]，骨内种植的酶组化研究和机体T淋巴细胞亚群的评价，均证实了DLC－Ti比纯钛有更好的生物相容性。种植材料对免疫系统的影响同种植成功率以及术后并发症的发生有关[4]。本实验将DLC－Ti、纯钛、医用不锈钢和纯铜植于小鼠体内，检测材料对机体NK细胞活性和IL－2产生能力的影响，进一步探讨DLC－Ti对免疫系统的影响。
表1 术后NK细胞活性(％)变化( ±S) |
| 时间/（周） |
A（组） |
B（组） |
C（组） |
D（组） |
E（组） |
| 1 |
10.79±2.94 |
8.54±1.76△ |
7.73±2.13△△ |
4.87±0.87△△＊＊ |
4±56＋1.48△△＊＊ |
| 2 |
213.04±1.63 |
11.43±3.47 |
8.40±2.08△△＊ |
6.29±2.26△△＊＊ |
8.73±2.59△△ |
| 4 |
431.63±4.76 |
25.40±4.48△△ |
23.14±3.14△△ |
22.073±10△△ |
1.15±6.97△△＊＊ |
| 6 |
612.21±1.72 |
11.41±2.45 |
9.11±2.31△△＊ |
5.66±1.40△△＊＊ |
4.69±2.03△△＊＊ |
| 注：同A相比△P<0.05，△△P<0.01 同 B相 比 ＊P<0.05，＊＊P<0.01 n=7,表2同此
1材料和方法
1.1植入材料
选用4种材料：DLC－Ti、纯钛、8－18镍铬不锈钢合金和纯铜（作阳性对照）。上述材料制备成5×2×1mm3长方体，于实验前酒精梯度脱酯，高压灭菌后备用。
1.2主要试剂与细胞株
1.2.1YAC-1细胞株（小鼠T淋巴瘤细胞株），CTLL-2细胞株（小鼠细胞毒T细胞株）。均由中国医科大学微生物教研室传代培养。
1.2.2ConA（Vnt刀豆蛋白－A,Sigrna）使用浓度为10μg/ml。
1.3动物实验方法
健康雄性BALB/C鼠175只，体重18±2克，随机分作5组，每组35只，A组（对照组）；B组（DLC－Ti组）；C组（纯钛组）；D组（医用不锈钢组）；E组（纯铜组）。在每个实验组的小鼠左侧大腿内侧种植一种材料，对照组只进行切开缝合。分别于术后1、2、4、6周取脾检测NK细胞活性和IL－2产生能力。
1.4NK细胞活性测定方法[5,6]
1.4.1效应细胞制备：分离脾细胞悬液，调整细胞数为5×106/ml。
1.4.2靶细胞制备：取传代培养数YAC－1细胞，调整细胞数为1×105/ml。
1.4.3NK细胞活性测定：取96孔细胞培养板，每孔加效应细胞0.1ml，靶细胞0.1ml，最大释放细胞加10％NP－40于靶细胞中，自然释放组加0.5％BSA－RPMI1640液0.1ml代替效应细胞，置5％CO2、37℃培养箱中培养4小时，每孔加RPMI－1640液0.5ml，离心，弃上清0.1ml，加LDH液底物混合液0.1ml，作用1小时后测OD值（λ=490nm），计算NK细胞活性。
1.5IL－2产生能力的测定[5,7]
1.5.1IL－2诱生：制备脾细胞悬液，用含5g/mlConA的营养液调整细胞数为5×106/ml，置5％CO2培养箱中48小时，离心过滤，收集富合含IL－2的上清液，－20℃保存待测。
1.5.2检测细胞的制备：取传代培养24～48小时的CTLL－2细胞，调整细胞数为1×105/ml。
1.5.3IL－2活性单位测定：倍比稀释待测样品及标准品，每孔加CTLL－2细胞0.1ml，MTT液25μl，5％CO2培养箱培养4～6小时，每孔加10％NP—40100μl，4℃避光过夜，测OD值（λ=570nm），计算标本IL－2活性单位。
2实验结果
2.1NK细胞活性测定结果
同对照组相比，各实验组的NK细胞活性都有降低，DLC－Ti组在术后1、4周NK细胞活性受抑制明显，至第6周基本恢复正常，同对照组相比无统计学意义，而其它实验组的NK细胞活性都受到明显抑制，且同DLC－Ti相比差异也显著，见表1。
将对照组（A组）的数值作参考值，设为100％，其它各材料组的数值同参考值相比较得出相对变化百分率，绘制成各组NK细胞活性的相对变化趋势，见图1。
2.2IL－2产生能力的测定结果
各实验组的IL－2产生能力同对照组相比都有降低趋势。DLC－Ti组在第4周时IL－2产生能力受抑制非常明显，至第6周时同对照组相比，无明显差异，说明基本恢复正常。纯钛和医用不锈钢组的IL－2产生能力在前4周降低明显，第6周时降低同对照组相比无统计学意义，说明也基本恢复正常，而纯铜组的IL－2产生能力始终未能恢复，见表2、图2。
图2术后各组IL－2产生能力（％）变化趋势（±S）
图1术后各组NK细胞活性（％）变化趋势
表2 术后IL－2产生能力（u/ml)变化情况（±S） |
责任编辑：姚红祥 |