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【摘要】目的：了解转化生长因子－β（TGF－β)诱导骺板软骨细胞增殖的作用。方法：采用鸡胚股骨无血清培养、PCNA(细胞核增殖抗原)免疫染色方法研究对骺板软骨细胞增殖的作用。结果：PCNA阳性软骨细胞数目与分布部位与TGF－β作用剂量、时间密切相关,PCNA阳性细胞分布区域和数目远多于对照组,根据染色情况可以将PCNA阳性细胞分为S期和非S期细胞二种。结论：TGF－β能诱导非增殖软骨细胞表达PCNA,用PCNA作为细胞增殖的指标是不适宜的。
转化生长因子－β(TGF－β)是骨组织重要的多功能生长因子,它在软骨内成骨过程中起着积极的作用[1]。以往研究发现该生长因子的生物学效应与细胞分化、细胞基质和血清是否存在密切相关[2]，最近王凡等[3]用流式细胞仪研究骺软骨细胞周期的结果也表明TGF－β对软骨细胞增殖作用呈多样性。为提示TGF－β对骺板不同部位软骨细胞增殖的关系，我们用免疫组化方法观察PCNA（细胞增殖核抗原）的表达，在原位上观察TGF－β对软骨细胞增殖的作用。
1．材料与方法
1.1材料
TGF－β由第四军医大学西京医院孙玉鹏博士提供[4]。单克隆抗增殖细胞核抗原（proliferatingcellnuclearantigen,PCNA）血清购自美国DakoCO。
1.2方法
用终浓度为0.11ng/ml、0.33ng/ml、1.00ng/ml、3.00ng/ml的TGF－β分别对无血清网格器官培养的14天鸡胚股骨进行作用，并设空白对照组。收集24、48、96小时实验组及对照组的培养骨。随后标本进行特定方法固定和包埋，制成7μm厚的切片。PCNA免疫细胞化学（ABC法）染色。切片水化后，经微波（国产Galanz微波炉750W）修复抗原5分钟与抗PCNA抗体（1：80）4孵育过夜。ABC复合物作用后经DAB显色。同样设置阴性对照。将阳性反应分为三级，分别为（＋）弱阳性、（＋＋）阳性和（＋＋＋）强阳性。
2结果
各实验组的骺板增殖区、成熟区至肥大区均见大量PCNA阳性细胞分布，染色强度不一。光镜下，按染色情况可将PCNA阳性细胞分为S期和非S期二种情况[5]，S期PCNA阳性细胞核内充满棕褐色的染色颗粒，染色颗粒分布在细胞核间隙和核膜的周围，染色较深，呈强阳性（＋＋＋），24小时后各实验组的阳性细胞主要位于骺板增殖区，成熟区和肥大区仅见少量阳性细胞（图1）。TGF－β作用48小时后，S期PCNA阳性细胞主要分布于骺板成熟区和肥大区，其中0.33ng/ml组数目最多，1.00ng/ml组数目最少（图2）。非S期PCNA阳性细胞分布范围广而多，所有区域均有分布，染色颗粒浅而松散，可以同时或分别出现在细胞核和细胞质内（图3），非S期PCNA慢性细胞的表达与TGF－β作用时间和剂量有关（附表），少数阳性细胞镜下无法确切区分S期和非S期阳性细胞。
对照组PCNA阳性细胞均为S期阳性细胞，数目较少，散在分布于骺板增殖区、成熟区，未发现非S期PCNA为阴性（图4）。（图1～4见封二彩图）
附表TGF－β对骺板软骨细胞非S期PCNA表达的影响
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Groups |
24h |
48h |
96h |
| 0.00ng/ml |
- |
- |
- |
| 0.11ng/ml |
+++ |
+ |
+ |
| 0.33ng/ml |
+ |
++ |
++ |
| 1.00ng/ml |
++ |
++ |
++ |
| 3.00ng/ml |
+ |
+++ |
++ |
PCNA表达－阴性，＋弱阳性，＋＋阳性，＋＋＋强阳性
3讨论
PCNA是细胞DNA聚合酶δ的附蛋白,在S期参与DNA的复制,目前认为它的表达是衡量细胞增殖的重要指标并被广泛应用[6,7]。本实验亦用PCNA作为S期细胞的标志观察骺板软骨细胞的增殖情况，发现TGF－β可以促使PCNA的表达，且存在着量效和时效关系，这是以往未见报道。McCormick等[8，9]认为处于正常周期中各期细胞均可不断表达PCNA的mRNA，非S期多数在翻译成蛋白质之前就被降解以维持细胞内mRNA一定水平，但一些生长因子（如TGF－α和PDGF)和癌基因产物(如c－myc)可以调节PCNAmRNA的水平和蛋白质的表达,促进mRNA迅速和最大限度地翻译成蛋白质[10,11]。TGF－β通过何种途径促使软骨细胞表达PCNA目前尚不清楚,直接作用还是通过产生其它因子间接作用有待于进一步研究。作者的研究已表明TGF－β在影响软骨细胞增殖分化作用时可以诱导癌基因c－myc的表达。
责任编辑：姚红祥 |