【摘要】目的：研究牙龈卟啉单胞菌内毒素对成纤维细胞在纯钛表面附着的影响。方法：通过对种植体周围牙龈卟啉单胞菌内毒素脂多糖的提取、鉴定以及对成纤维细胞的作用，同时结合光镜及电子显微镜观察与统计分析。结果：发现成纤维细胞在牙龈卟啉单胞菌内毒素作用下在纯钛表面生长形态改变，趋动附着能力降低。结论：牙龈卟啉单胞菌内毒素具有抑制成纤维细胞在纯钛表面附着的作用。

　　随着口腔种植材料与种植技术的不断提高，牙种植体已广泛应用于临床，并取得较高成功率。但是，一些种植体周围牙龈出现类似于牙周炎的症状，被称作种植体周围炎（peri implan titis)[1]。以前人们主要从种植材料、手术技能、修复技术、患者骨量及生物力学等方面的影响予以考虑得多，目前人们对微生物引起种植体周围炎日益重视。本研究探讨种植体周围组织受到细菌感染后，成纤维细胞在细菌产物内毒素（LPS）的作用下，可能出现在种植材料表面附着能力降低，造成附着丧失，种植体颈部纤维封闭破坏，使得种植牙周袋加深。通过实验，为临床防治该疾病提供理论依据。

1　材料和方法

1.1　实验材料
1.1.1菌种：口腔G-厌氧牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,PG)该菌取自患中、重度种植体周围炎的种植体周围龈下，经菌落特征、革兰氏染色特性和形态、生化反应等实验证实，并经厌氧培养扩增后，用PBS洗脱离心收集，得湿菌4g。
1.1.2鲎试剂和大肠杆菌O11B4内毒素标准品均购置于厦门鲎试剂厂，批号分别为（88）卫药SJ－03和1402－9605,敏感度为1EU/ml。
1.1.3培养细胞与培养液：采用人皮肤成纤维细胞（由浙江大学医学院附属第二医院骨科提供）。培养液为DMEM（GIBCO公司）加15％小牛血清加青霉素100u/ml加链霉素100ug/ml加0.3％谷胺酰氨；消化液为0.125％胰酶（DACO公司）＋0.02％EDTA。
1.1.4纯钛金属板（pure titanium)购于浙江省生物制品厂，其厚度为1mm,表面光滑度达一级[2]。
1.2　实验方法
1.2.1牙龈卟啉单胞菌内毒素（PG－LPS)的提取：采用改良酚水法[3]。
1.2.2PG－LPS的鉴定
1.2.3PG－LPS纯度及类型鉴定：PG－LPS经硝酸银染色，电泳测定。
1.2.4鲎试验：采用试管法[4]。
1.3　PG－LPS对成纤维细胞在钛表面附着的影响
1.3.1细胞培养与扩增。
1.3.2材料表面培养前预处理及分组:将纯钛金属片和载玻片切成0.5cm×1cm大小各12片，先后放入丙酮、无水酒精、去离子水中清洗15分钟。取6只干净培养瓶，每瓶分别放入经清洗的纯钛金属片和玻片各两片，包扎后经160℃干烤两小时灭菌备用。每3瓶为一组分成两组。
1.3.3细胞接种：扩增培养的成纤维细胞经消化后用培养液制成细胞悬液，反复摇匀后等量分装入两组培养瓶中，实验组加入PG－LPS，使培养液含终浓度为80000EU/mlPG－LPS,而对照组加入正常培养液作为对照。两组细胞均置于37℃5％～7％CO2培养箱中培养。
1.4　观察项目
1.4.1光镜观察：加入PG－LPS后，每隔24小时在倒置显微镜下观察两组细胞在钛边缘上生长情况，共观察4天。
2.4.2细胞附着的定量分析：每个样品取3个同样放大倍数的光镜视野，调节样品使其占居视野一半，再数出视野中附着于试样边缘细胞个数即每视野附着细胞数。每视野附着细胞均数=各个视野附着细胞数之和除以总视野数。
1.4.3扫描电子显微镜观察：将培养4天后的样品取出，经PBS（0.1M,ph7.0)缓冲液漂洗后用4％戊二醛固定，PBS漂洗，锇酸固定，临界点干燥，喷金，观察并摄片。

2　结果

2.1　PG－LPS的产量
　　从4克PG湿菌中共获得冻干PG－LPS3.3毫克。
2.2　PG－LPS的纯度及类型鉴定
　　自制PG－LPS和对照LPS经硝酸银染色后电泳并摄片，结果如图1所示。

图1　PG—LPS电泳图

　　样品依次为：（1）R595粗糙型细菌内毒素。前面二条带为核心Lipid A,而后面缺失多糖链。（2）S.abortusegui光滑型细菌内毒素。可见Lipid A后有大量长度不等的多糖链。（3）和（4）自制PG细菌内毒素。可见只有LipidA条带而无多糖链。因此该内毒素为粗糙型内毒素。纯度已达电泳纯（银染）。

责任编辑：姚红祥