2.7 逆转录反应及PCR
　　逆转录反应按试剂盒说明进行。
　　PCR参考文献[5, 6]方法进行PCR，产物经过1.2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色。

结果

　　1 P18对于成骨细胞增殖的影响依据培养条件的不同而产生不同的作用
　　P18对于成骨细胞系MC3T3-E1增殖的影响（图1）表现为在无血清培养时，在多肽浓度 0-5ug/ml范围内表现为促进增殖的作用，高于此范围时随着多肽浓度的增加细胞增殖受到抑制。在2.5%血清存在时，P18的浓度0-15ug/ml范围内表现为促进增殖的作用，高于此范围时随着浓度的增加细胞增殖受到抑制，其促进增殖作用增强而抑制增殖的作用减弱。在10%血清存在时，P18作用表现为促进细胞增殖。

图1　不同培养条件下P18 对于MC3T3-E1
细胞增殖的影响

　　2 P18增加COL1的表达
　　采用敏感、特异并可定量检测基因表达的方法竞争性RT-PCR检测COLI的表达，选择在大多数细胞内均为高表达的β-actin作为内对照，凝胶电泳结果（图2A）经扫描后用图象分析软件计算COLI/β-actin的比率，结果表明P18能够显著增加COLI的表达量，并表现为一定的剂量效应。

图2　PCR 产物凝胶电泳图谱
M.PCR 标志物，由上而下片段大小分别为2kb、1kb、750bp、
500bp、250bp、100bp;1,3,5为对照组，2 为20ug/ml P18 处理组;
4，6 为50ug/mlP18 处理组.

　　在本实验条件下，实验组与对照组均未检测到骨钙蛋白的表达（图2B）。
　　3 P18对于成骨细胞的ALP活性没有明显的影响P18对MC3T3-E1的ALP活性在本实验条件下未观察到明显的影响（图3）。在0-100ug/ml的范围内，细胞ALP活性没有明显的改变。

图3　P18 对于MC3T3-E1细胞ALP活性的影响

讨论

　　MC3T3E1细胞系来源于新生小鼠颅骨，能够分化成成骨细胞并在体外矿化，关于该细胞株的形态等生物学特点已经比较清楚[7]，总的说来，该细胞属于尚未分化成熟的成骨样细胞。TGF-β是一个多功能的生长因子，参与体内多种病理和生理过程，并在创伤愈合、免疫抑制等方面具有重要的临床应用前景，局部或全身应用TGF-β已经被用于软组织修复、骨修复和缺血损伤修复[8]。由于天然蛋白的种种不利因素，我们根据自己的研究目的设计合成了一段新型TGF-β样多肽分子P18。
　　文献报道的TGF-β对于成骨细胞的体外作用一般为促进细胞增殖，本试验结果表明P18对于成骨细胞具有促进增殖的作用，但是其作用和血清的浓度有密切的关系，说明其和血清中的某些成分关系密切，这些血清成分有可能是纤维连接蛋白（fibronectin）等细胞外基质蛋白或者其它生长因子，是否天然TGF-β也存在这一现象目前还未见文献报道。
　　天然TGF-β对于成骨细胞ALP活性的影响和它促进细胞增殖的作用相反，即在促进增殖的条件下，TGF-β降低成骨细胞ALP活性，而在起抑制作用条件下却增加ALP的表达。P18在促进细胞增殖的条件下对于MC3T3-E1细胞的ALP活性并无明显影响，由于MC3T3-E1细胞株属于尚未分化成熟的成骨细胞，推测造成这一现象的原因可能与TGF-β协调细胞成熟分化作用有关。
　　COLI是成骨细胞分泌的主要基质蛋白之一，和天然TGF-β一样，P18能够明显增加COLI的表达，这一点对于其用途具有重要的意义，由于合成的P18还具有羟基磷灰石（HA）结合能力，可以吸附在HA表面而使材料表面的成骨细胞加速分泌细胞外基质并促进其增殖，使材料和骨组织之间迅速达到生物结合。本实验条件下未观察到骨钙蛋白的表达，这可能由于MC3T3-E1细胞是一种尚未分化成熟的细胞，而骨钙蛋白主要在成骨细胞分化成熟的晚期表达。
　　P18对于成骨细胞的作用与天然TGF-β相似，由于它还具有天然TGF-β所没有HA结合能力，在HA类骨修复材料的改进以及种植体涂层修饰方面有着广阔的应用前景。

责任编辑：姚红祥