牙本质仿生矿化的研究进展

    牙本质是牙体硬组织的主体部分，作为一种结构高度有序的有机-无机复合物，其一旦形成了实质性缺损，将无法自行修复，临床上现行的复合树脂充填术也无法良好地恢复牙本质天然结构和生理功能。牙本质的仿生矿化（biomimetic mineralization）是指在体外模拟牙本质的生物矿化过程，获得与天然牙本质相似的有机-无机复合材料，为缺损牙本质的修复提供了新的思路和方向。
    1.牙本质的生物矿化过程
    成熟牙本质中，无机矿物相的质量分数为70%，有机基质占20%，其余成分为水。牙本质的生物矿化是一个由成牙本质细胞及其分泌的细胞外基质介导的动态过程，包括有机基质分泌和随后的晶体沉积两大过程。生理状态下，成牙本质细胞合成和分泌有机基质到细胞外，以Ⅰ型胶原为主的胶原成分约占90%，非胶原蛋白（non-collagenous proteins，NCPs）约占10%，二者对牙本质的生物矿化均起重要调控作用。
    在牙本质生物矿化过程中，Ⅰ型胶原分子自组装成胶原纤维，可作为矿物沉积的模板；另一方面，NCPs具有较强的钙离子结合能力并能吸附到胶原纤维上，可以稳定矿化前驱体形成无定形磷酸钙（amorphous calciumphosphate，ACP），同时修饰胶原纤维提供成核位点。在二者的调控之下，晶体长大并有序沉积，最终形成矿化的牙本质。
    根据牙本质中矿物与胶原纤维的相对位置，牙本质的矿化可分为胶原纤维间矿化和胶原纤维内矿化。纤维间矿化是矿物在胶原纤维之间无序沉积，取向混乱，纤维内矿化则表现为矿物在纤维内部沿着胶原纤维长轴定向排列。这种基于纤维内矿化的高度有序的有机-无机复合结构，赋予了牙本质优异的生物学和机械力学性能。
    2.牙本质仿生矿化的机制研究
    纤维内矿化是牙本质生物矿化的重要环节，胶原纤维、NCPs和ACP在整个矿化过程中具有重要作用，因此理解这三者在纤维内矿化中的相互作用机制，是借助仿生矿化手段构建牙本质仿生修复策略的基础。学者们尝试使用多种材料和方法在体外诱导胶原纤维的矿化，通过多种检测技术和分析手段，对ACP、NCPs及其类似物和胶原纤维在纤维内矿化中的可能作用作出了不同的猜测。
    2.1 ACP
    ACP是羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）形成过程中的中间态成核前驱体，是一种亚稳态相，易转化为热力学稳定的晶体相。诱导ACP在纤维内定向排列并转化为有序沉积的HA，是在体外实现纤维内仿生矿化的基础。Gower等提出的聚合物诱导的液相前驱体（polymer induced liquid precursor，PILP）理论认为，带大量电荷的聚阴离子等化合物能够诱导水合非晶态的矿化前驱体形成稳定的、具有液态性质的ACP液相前驱体。
    当ACP液相前驱体与胶原纤维接触时，将会通过毛细作用被吸入到纤维内部的不规则纳米间隙中。在纤维内部，液态前驱体失去结合的水而固化、结晶，在胶原纤维的模板作用下，最终形成胶原纤维内HA晶体的有序沉积。
    2.2 NCPs及其类似物
    NCPs的结构中富含天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸等酸性氨基酸残基，带有大量负电荷，具有较强的钙离子和HA结合能力，作为矿化的启动因子、稳定因子或抑制因子从而调控矿物沉积。但天然NCPs提纯困难且昂贵，导致其体外研究及应用受限。因此，大多研究使用与NCPs具有相似结构和理化性质的NCPs类似物，以在体外模拟NCPs在生物矿化中的功能，如聚天冬氨酸（polyaspartic acid，PAsp）、聚酰胺-胺[poly（amido amine），PAMAM]树枝状分子、聚丙烯酸（polyacrylic acid，PAA）和聚乙烯基磷酸（poly-vinyphosphonic acid，PVPA）等。
    PAsp带有大量负电荷，能够稳定ACP形成液相前体，使其进入胶原纤维内部有序沉积。此外，PAsp还能与ACP形成带大量负电荷的复合物，通过静电作用与胶原纤维结合，介导ACP向胶原纤维内部渗透。
    PAMAM 能够模拟NCPs的双重功能:一方面，PAMAM 可以结合并稳定ACP；另一方面，PAMAM 能与胶原纤维结合使其成为矿化模板，吸引ACP进入胶原纤维内部矿化。PAA富含羧基，能与ACP结合阻止其在胶原外聚集；PVPA含有磷酸酯基团，可与胶原上的特定位点结合，磷酸化胶原纤维成为矿化模板，联合使用PAA和PVPA能够诱导HA晶体在胶原内部的有序沉积。
    2.3 胶原纤维
    胶原纤维的结构和电荷分布能够影响和调控矿化进程。胶原纤维上具有长约67nm 的周期性重复序列，包括27nm的重叠区和40nm 的孔区。由于孔区的存在，胶原纤维具有选择性半透膜的特性，仅允许分子量<6000的分子自由通过，而分子量>40000的大分子无法通过。基于这一特性而提出的“抑制剂排除理论”，认为成核抑制剂的相对分子质量较大，无法进入胶原纤维内继续稳定磷酸钙，因此被稳定在较小尺寸的磷酸钙晶体将从孔区处进入胶原纤维内部形成纤维内矿化。
    Niu等提出，在矿化进程中，半透膜两侧（即胶原纤维内外）电荷和渗透压由不平衡到平衡的动态过程，为ACP进入胶原纤维、进而诱导形成纤维内矿化提供了驱动力。另一方面，在靠近胶原纤维C末端有一段带正电荷的区域，能够通过静电作用吸引带负电的聚阴离子——ACP复合体从而介导ACP进入胶原内；而位于孔区和重叠区的带电氨基酸团簇可以形成成核位点，诱导进入纤维内部的ACP相转变为沿着胶原长轴有序排列的HA晶体。
    而Wang等则认为，纤维内矿化并不需要NCPs的参与，经过修饰后的胶原纤维可独立诱导纤维内矿化，然而这与生物矿化中有多种NCPs参与的事实相悖。 随着技术的进步，人们对胶原纤维、ACP和NCPs及其类似物在纤维内矿化过程中相互作用的认识不断深入，为牙本质仿生矿化的应用研究奠定了坚实的理论基础。
    3.牙本质仿生矿化的应用研究
    龋坏牙本质和树脂-牙本质粘接界面混合层的仿生矿化，是牙本质修复领域的研究难点。为了更好地研究和解决这些问题，学者们开展了诸多体外实验，为牙本质仿生矿化的临床应用奠定基础。
    Burwell等在钙磷矿化液中添加成核抑制剂PAsp，在2~4周内实现了人工牙本质龋模型的仿生矿化，同时观察到纤维内、外矿化，并基本恢复了牙本质机械性能。由于硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS）广泛存在于矿化组织中，He等使用CS修饰胶原纤维发现其能够促进纤维内矿化，而且经CS固定化后的脱矿牙本质仿生矿化速度明显加快，提示其用于牙本质修复的潜能。
    Qu等发现聚多巴胺能够降低ACP与胶原纤维之间的界面能，促进ACP进入胶原纤维内部从而促进纤维内矿化，聚多巴胺预处理可以实现脱矿牙本质的仿生矿化。还有一些研究将小分子化合物作为预处理剂以研究其对仿生矿化进程的影响。
    Shao等使用柠檬酸对脱矿牙本质进行预处理后置于含PAA的矿化液中反应，结果表明柠檬酸能够通过改善有机-无机界面反应，有效促进脱矿牙本质仿生矿化，在缩短矿化时间的同时提高矿化程度。同样，为了改善矿化后牙本质的机械力学性能和生物稳定性，有学者将脱矿牙本质表面经戊二醛预处理后置于含PAA的溶液体系中矿化，发现牙本质的仿生矿化效果显著提升。
    戊二醛是一种化学交联剂，其诱导牙本质仿生矿化的可能机制是诱导塌陷的牙本质胶原纤维交联成网状并提供钙离子吸附位点。上述基于溶液的仿生矿化系统虽然能够加速牙本质仿生矿化进程，提高矿化程度，但是液体矿化环境在口腔中的应用仍存在困难和挑战。
    为使牙本质仿生矿化修复理念更适用于临床，学者们对仿生分子应用形式和钙磷供给形式进行了深入探究和改良。在壳聚糖中引入羧甲基得到的羧甲基壳聚糖（carboxymethyl chitosan，CMC），结构中同时具备羧基和氨基两种带不同电荷的基团，能够稳定ACP并促进胶原纤维内矿化。
    Chen等将CMC/ACP复合物冻干后用于处理牙本质深龋模型，结果表明CMC/ACP能够诱导脱矿牙本质胶原纤维的纤维内矿化并在一定程度上重建牙本质的结构，实现“自下而上”的仿生修复。此外，Huang等发现添加有CMC的实验性树脂能够诱导脱矿牙本质仿生矿化，改善人工牙本质龋损的粘接性能。粘接剂作为牙本质粘接修复中必不可少的一环，目前已成为仿生矿化领域具有重要研究意义的载体形式。
    Wu等制备了PAsp稳定的无定形磷酸钙（PAsp-Si-ACP）颗粒，并将其添加到临床常用的自酸蚀粘接剂中，研究发现ACP能够从粘接剂中释放出来并作用于树脂-牙本质粘接界面，诱导形成一定厚度的仿生矿化层。但该矿化层与天然牙本质的结构仍存在较大差距，HA晶体密度较低，矿化速率也较慢。虽然粘接剂在形式上更贴近临床应用，但由于其用量的限制，无法源源不断地提供钙磷离子，在一定程度上限制了牙本质仿生矿化的程度和矿化层厚度。除了粘接剂，将仿生分子稳定的ACP负载到介孔二氧化硅中是对仿生矿化应用形式的另一探索。
    当分别以介孔硅和扩孔介孔硅作为PAA稳定ACP（PAA-ACP）的载体时，均可观察到PAA-ACP从载体中释放并诱导胶原纤维发生纤维内矿化。有学者提出将负载ACP的介孔硅作为粘接剂的填料，可能实现脱矿牙本质更快速和更有序地仿生修复，但目前仍缺乏相关实验证据来进一步证实其在人工牙本质龋模型中诱导仿生矿化的潜能。
    4.总结与展望
    基于仿生理念的牙本质矿化研究为恢复牙本质的天然结构和生物力学性能提供了可能性，进而为牙本质修复提供了新的思路。目前的牙本质仿生矿化研究虽已取得一定进展，但仿生矿化所需时间较长，获得的牙本质在矿化程度及晶体排列有序度方面相对不足，并且矿化所需钙磷离子的持续和足量供给尚未实现，如何有效实现在组成、结构和功能等方面均与天然牙本质接近的仿生矿化仍是一大难点。
    此外，大多数体外仿生矿化研究在液体环境中进行，其临床应用形式仍有待进一步探索。因此，牙本质仿生矿化研究需要结合体内外研究以进一步缩短矿化时间，提高矿化程度和仿生度，寻找持续的钙磷供给并改良应用形式，为牙本质仿生矿化临床应用的实现奠定基础。