牙髓再生相关细胞因子研究进展

    牙髓是牙齿内部唯一的软组织，其四周为硬组织包绕。牙髓内的血管、淋巴管和神经仅通过细小的根尖孔与根尖周围软组织相连，这种解剖特征限制了牙髓再生性修复的能力。目前传统的根管治疗完全去除了患牙的牙髓组织，牙齿因而失去营养、免疫防御、感觉等功能，牙冠变脆，极易出现感染和牙根折断等并发症。因此，牙髓根尖周病的再生性治疗是未来的趋势。
    随着分子生物学、生物材料学、组织工程学等学科的不断发展，通过细胞归巢、干细胞移植等技术进行牙髓-牙本质复合体的再生治疗已成为可能。在牙髓再生过程中，血运系统的重建是牙髓-牙本质复合体发育和再生的关键。然而，牙髓血运重建的机制极为复杂，需要微环境中一系列细胞因子的参与及调控。文章选取了近期作为研究热点的几类牙髓再生的相关细胞因子，对其在牙髓再生中的研究进展作一综述。并以基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)为例，重点探讨其在牙髓再生中的作用及调节机制。
    1. SDF-1
    1.1 SDF-1的基本概念
    SDF-1，又称趋化因子配体12(chemokine(C-X-C motif)ligand 12，CXCL-12)，是一种对T淋巴细胞和单核细胞趋化的CXC趋化因子。它主要通过与特定的G蛋白偶联受体CXCR4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)结合，在各种组织的基质细胞上组成性表达，进而促进下游效应，调节多种生理过程，如器官发生、再生和肿瘤发生。
    此外，外周循环中SDF-1过表达可诱导包括内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)在内的造血祖细胞和干细胞动员。Carmeliet等发现，SDF-1与CXCR4结合可启动某些信号通路，这些通路可激活血管生成过程中的各种重要反应，如趋化、细胞增殖、迁移和血管生成因子的分泌。由此可见，SDF-1/CXCR4轴是促进细胞归巢的重要生物轴，同时在介导炎症反应、肿瘤转移、血管生成和组织再生等病理生理过程中发挥多重作用。
    1.2 SDF-1在牙髓再生中的相关研究
    Bae等发现给8周龄免疫缺陷小鼠单独注射人牙周膜干细胞或人脐静脉内皮细胞时，其皮下均不能观察到血管样结构的形成，而两者共同注射时，有血管样结构形成且与宿主的循环系统吻合。使用CXCR4拮抗剂AMD1300阻断SDF-1α/CXCR4轴后，未发现明显的血管样结构形成，表明SDF-1α/CXCR4轴在牙髓血管再生中发挥重要作用。
    Wang等用来源于施万细胞的细胞外囊泡(extracellular vesicles derived from Schwann cells，SC-EVs)处理了牙髓干细胞和骨髓干细胞，结果显示这两种细胞的增殖、迁移和成骨向分化明显增加。在皮下的体内模型中，SC-EVs增强了内源性血管内皮样细胞和间充质干细胞的募集，并促进了牙髓-牙本质复合体样结构的形成。最后，质谱分析和Western Blot结果显示，SDF-1在SC-EVs中起主导作用。说明施万细胞来源的细胞外囊泡可通过SDF-1/CXCR4轴募集内源性干细胞促进牙髓再生，而无需外源性细胞移植，这为临床实现牙髓再生提供了新的思路。
    Zhu 等使用预先制备的慢病毒感染人的牙髓干细胞(dental pulp stem cells， DPSCs)，结果表明基因修饰的DPSCs分别表达高水平的SDF-1α和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF) mRNA以及蛋白。转染的DPSCs与野生型的DPSCs相比，其增殖能力显著提高。此外，SDF-1α和VEGF还能促进体外基膜上内皮细胞的迁移和血管的形成。DPSCs/SDF-1α和混合DPSCs/SDF-1α+ DPSCs/VEGF组的血管表面积密度显著高于单独或野生型DPSCs组。此项研究表明：SDF-1α过表达的DPSCs在体内可增强血管化牙髓再生面积。
    1.3 调节SDF-1或SDF-1/CXCR4轴进而影响牙髓再生的因素
    Choi等研究发现，SDF-1的启动子中包含2个缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)的结合位点，该结合位点发挥作用后，SDF-1的转录得以激活，转录后SDF-1的表达迅速升高，最终使损伤区域SDF-1水平高于外周。组织缺血缺氧时，HIF-1能够快速表达。在DNA损伤诱导剂和化学治疗的作用下，SDF-1生成增多；在转录水平上，HIF-1能够使SDF-1表达上调。由此可见，SDF-1的表达量与缺氧程度呈明显正相关，其中，HIF-1是重要的调节因素。
    Olaptesed pegol(OLA-PEG，简称NOX-A12)是一种新型聚乙二醇化的镜像寡核苷酸，NOX-A12的45个L-对映体RNA核苷酸形成结构支架，可高亲和性、竞争性识别并结合SDF-1，因此能有效抑制SDF-1与受体CXCR4和CXCR7的相互作用，从而影响SDF-1/CXCR轴的信号传导。Citro等在同基因的门静脉内胰岛移植小鼠模型和多个低剂量链霉菌素诱导糖尿病模型中，评估了SDF-1特异性NOX-A12对胰岛存活的影响。研究结果表明NOX-A12可有效阻断SDF-1，是提高胰岛移植和生存的有效策略。
    此外，Steurer等的研究显示NOX-A12联合苯达莫司汀和利妥昔单抗治疗慢性淋巴细胞白血病效果较好，且在先前的NOX-A12单药治疗安全性和药代动力学评估中没有观察到剂量限制毒性。因此，这种新型SDF-1抑制剂为牙髓再生中抑制SDF-1/CXCR轴提供了新思路。
    除了NOX-A12，使用SDF-1抗体中和SDF-1也是阻断SDF-1/CXCR4信号轴的重要途径。Janssens等的研究发现：在癌症、病毒感染、类风湿关节炎和骨关节炎、哮喘和急性肺损伤等疾病中，使用SDF-1中和抗体或非典型趋化因子受体3(atypical chemokine receptor 3，ACKR3)小分子拮抗剂可以阻断SDF-1/CXCR4轴，延迟疾病发作或阻止疾病进展。Liu等研究表明CXCL12/CXCR4信号通路通过中枢致敏机制参与神经性疼痛的发生和维持。而单次鞘内注射CXCL12中和抗体可暂时逆转神经性疼痛大鼠模型的神经性疼痛。连续使用CXCL12中和抗体则可导致神经性疼痛诱导显著延迟，脊髓背角胶质纤维酸性蛋白和小胶质细胞标志物表达降低。
    Liu等还提出，乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid， EDTA)可通过上调CXCR4的表达促进SDF-1α诱导的牙髓细胞迁移且CXCR4的表达与转化生长因子-β1信号通路有关。研究表明12% EDTA刺激增强SDF-1α诱导的牙髓细胞迁移。TGF-β1和CXCR4的表达均在12% EDTA作用下呈时间依赖性增加。沉默CXCR4后，EDTA增强的牙髓细胞迁移减少。
    除上述四种影响因素外，年龄、炎症环境、缺血损伤等都可上调SDF-1的表达。缓冲液的使用也可能影响CXCR4的表达，进而影响SDF-1/CXCR4轴。Pervin等发现，虽然非酶解缓冲液仅仅保持了CXCR4的表达而并未增强，但所有测试的酶解溶液都显著降低了CXCR4的表达。因此，使用非酶解方法，然后通过细胞过滤器过滤获得单细胞悬浮液，可保持最大的CXCR4表达和最佳的细胞归巢。
    综上，SDF-1与CXCR4结合形成的SDF-1/CXCR4信号轴在介导细胞归巢、血管生成和组织再生等过程中发挥着重要生物学作用，近年来应用SDF-1进行牙髓再生方面的研究也取得了一定的成果。NOX-A12、SDF-1中和抗体、ACKR3小分子拮抗剂等能够抑制SDF-1/CXCR4信号轴从而达到治疗疾病目的，HIF-1、EDTA、年龄、炎症环境、缺血损伤等均可增强SDF-1/CXCR4信号轴从而趋化内源性细胞归巢进行牙髓的再生修复。
    2.几类研究广泛的牙髓再生相关细胞因子
    2.1 浓缩生长因子(concentrated growth factor， CGF)
    CGF是通过差速离心血液样品制备的一种天然生物材料，是最新一代血小板浓缩制品。与前两代相比，其相同体积中含有的生长因子更丰富、纤维蛋白基质的拉伸强度和黏度更高、作用于体内的时间更长，组织再生能力也更强。CGF中主要包括VEGF、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor， FGF)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein， BMP)等生长因子。Xu等的体内外研究表明，CGF对脂多糖暴露的人牙髓干细胞体外增殖、迁移和分化有积极作用，在体内还能促进比格犬未成熟单根牙牙本质-牙髓复合体的再生。因此，CGF在牙髓再生治疗中具有广阔的应用前景。
    VEGF是一种调节正常和病理血管生成过程的生长因子，具备重要的促血管生成活性，有促内皮细胞分裂、抗凋亡、增加血管通透性、促进细胞迁移等作用。李祥伟等采用VEGF微球进行体外释放实验和人脐静脉内皮细胞迁移实验，将装载DPSCs和VEGF的微球通过根尖孔注射到根腔，然后将其皮下移植到裸鼠体内，此后HE染色显示再生的髓样组织遍布整个根尖和根中三分之一。由此可见，VEGF微球能促进髓样组织的再生和血管的形成。
    碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor， bFGF)是一种有效的细胞增殖、运动和分化调节剂，其重要特性包括对肝素/硫酸肝素的高亲和力，以及氨基糖多糖向细胞外基质(extracellular matrix， ECM)的生理转移。Zeng等研究表明，bFGF可在DPSCs和根管冲洗后被检测到。bFGF受体(FGFR1和FGFR2)也被发现在人牙髓细胞中表达。此外，Luo等在体外实验发现，以肝素-泊咯沙姆(heparin-poloxamer， HP)为3D支架结合DPSCs与bFGF共培养后，可促进神经元的再生和组织损伤的修复。同时，该实验结果证明，bFGF可正协同DPSCs在神经发生和成骨过程中的调节作用。
    PDGF是血小板颗粒中携带的有丝分裂肽生长激素。当血小板黏附在受损组织上时，它就会释放出来，激活创伤区附近结缔组织细胞的复制过程。PDGF有两个受体酪氨酸激酶，即α-受体和β-受体，它们位于不同的染色体上。PDGF与受体结合可诱导二聚化和自磷酸化，以及信号转导分子的激活。Mead等的研究表明，人DPSCs可分泌PDGF-AA、PDGF-BB等生长因子，而根据酶联免疫吸附试验结果显示，PDGF-BB在人DPSCs中的过表达尤其能促进细胞增殖和成牙本质细胞分化。
    Zhang等提出，DPSCs分泌PDGF-BB可以增加干细胞通过磷酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路归巢的可能性，改善DPSCs介导的牙髓-牙本质复合体在体内的再生。由此可见，PDGF对促进DPSCs的增殖、成牙本质细胞的分化和牙本质-牙髓复合体的再生具有重要作用。
    TGF-β亚家族分为3个亚型，即TGF-β1、2和3，它们是由成熟的TGF-β和潜伏期相关肽组成的大分子前体，在胚胎发育、细胞分化、激素分泌和免疫功能中有潜在的作用。Ng等研究表明，重组TGF-β1能增强骨髓间充质干细胞和牙髓细胞增殖。Jiang等进一步提出，脂质体TGF-β1的释放随时间的延长而得到控制和延长，且100 μg/mL的脂质体无细胞毒性。因此，脂质体TGF-β1可作为增效剂促进未成熟恒牙牙本质-牙髓再生，或作为盖髓剂诱导修复性牙本质形成，这为临床上将TGF-β应用于牙髓再生治疗提供了有效的方案。
    BMP是转化生长因子-β超家族成员之一，是一种参与骨骼发育的因子，能够诱导间充质干细胞(mesenchystem cells， MSCs)体外成骨分化。Tóth等的研究表明，表达BMP-2的细胞系可以有效地控制转基因在DPSCs中的表达。此外，Tan等将混合了脱细胞牙髓细胞外基质(decellularized extracellular matrix ，dECM)和BMP4的DPSCs移植到裸鼠体内，观察其髓样组织形成情况。结果表明，成骨和成血管细胞基因表达增加，体内形成髓样组织。可见dECM促进DPSCs的增殖，BMP4和dECM共同促进DPSCs在体外形成髓样组织。因此，探索所有已知的影响成骨分化、成血管细胞基因表达的因素及其相互作用对探索牙髓再生的治疗方式具有重要意义。
    综上结合先前研究可见，浓缩生长因子来源于自身，避免了使用过程中的免疫排斥反应，且含有大量生长因子及独特的纤维网架结构。因此，浓缩生长因子在促进组织愈合、骨组织生长成熟、减轻炎症反应方面有显著作用。
    2.2 粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor， G-CSF)
    G-CSF是一种糖蛋白，其内部含有二硫键。当宿主受到感染或有组织损伤时，G-CSF与骨髓中中性粒细胞受体结合，诱导中性粒细胞前体细胞的存活、增殖和分化，并在功能上激活成熟的血液中性粒细胞。在集落刺激因子家族中，G-CSF是白血病髓系粒细胞和巨噬细胞终末分化最有效的诱导因子。
    粒细胞集落刺激因子在脑出血、充血性心力衰竭、失血性休克等动物模型中均显示出促进血管生成的潜能，可见粒细胞集落刺激因子能改善局部组织缺血的情况。Liang等通过脑出血大鼠模型研究得出，G-CSF增强磷酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路活性，促进B淋巴细胞瘤-2基因和VEGF表达，减少神经细胞凋亡，增强血管内皮细胞的管容量可能是G-CSF改善脑出血后神经功能和血管新生的机制。此外，Pourtaji等在有关 G-CSF应用于充血性心力衰竭治疗的综述中指出，G-CSF在慢性心力衰竭的治疗中是一个很有前景的靶点，它通过多种机制修复心脏并预防心脏重塑，具有足够的临床应用价值。
    此理论在牙髓损伤的治疗中仍然适用，Nakashima等将DPSCs与胶原中的G-CSF移植入去髓牙，24周后，根管内再生组织的核磁共振成像信号强度与正常牙髓相似。Iohara等在评估牙髓干细胞移植的有效性和安全性实验中得出，牙髓干细胞加G-CSF移植与无G-CSF相比，炎症细胞和凋亡细胞数量减少，神经突起生长显著增加。移植的干细胞表达血管生成/神经营养因子。结果表明，G-CSF与牙髓干细胞条件培养液共同作用，可促进细胞迁移和神经突生长，防止细胞死亡，促进免疫功能。
    2.3 其他
    其他因子如干细胞因子(stem cell factor， SCF)、重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin， rhEPO)、TNF-α/β等均能促进牙髓再生中的血管生成。SCF是具有强大功能的一类趋化因子，能诱导牙髓干细胞归巢、促进牙髓血管生成和组织重建。Ruangsawasdi等研究发现，在SCF存在的情况下，人间充质干细胞定向迁移、增殖和牙本质/成骨分化增加。
    SCF也在6周时增加了组织长入的范围，且在具有SCF的样品中，形成的组织显得更加成熟。在基因转录方面，牙基质蛋白1、胶原蛋白聚糖基因和VEGF显著上调，而牙本质涎磷蛋白基因和神经生长因子不受影响。该研究结果表明，在人类未成熟的牙齿中，SCF可以加速细胞归巢和牙髓-牙本质复合体的成熟。Koutsoumparis等研究表明， rhEPO处理初期可加速细胞增殖，使根尖乳头干细胞萌生微管结构。
    根尖乳头干细胞表达同源的EPO-R，而rhEPOa处理的根尖乳头干细胞表现出更高的EPO/EPOR通路相关分子的表达。由此可见，重组人促红细胞生成素可促进根尖乳头干细胞内皮转分化，在缺血性疾病的治疗中具有一定的临床应用价值。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor， TNF)主要由活化的巨噬细胞，NK细胞及T淋巴细胞产生，具有杀伤或抑制肿瘤细胞、提高中性粒细胞的吞噬能力、抗感染、促进细胞增殖和分化等能力。
    An等通过Matrigel实验显示，不同浓度TNF-α处理组的总分枝长度和分枝数量明显高于对照组。小管结构的分解次数也显著增加。浓度为50 ng/mL的 TNF-α能显著提高VEGF mRNA和蛋白的表达水平，同时，与TNF-α共培养后，人脐静脉内皮细胞和人牙髓干细胞的迁移能力增强。由此可见，在牙髓细胞和内皮细胞的共培养系统中，TNF-α可显著增加血管生成潜能。
    3.结论
    在牙髓再生过程中，血运系统的重建是牙髓-牙本质复合体发育和再生的关键。文章以SDF-1为例，对有关细胞因子在牙髓血运重建中作用及调节机制的研究进展进行了总结。在牙髓血管生成过程中，SDF-1与CXCR4结合可启动某些信号通路，这些通路可激活血管生成过程中的各种重要反应，如趋化、细胞增殖、迁移和血管生成因子的分泌。然而SDF-1在牙髓血管生成中起作用的更详细机制尚不明确，临床上如何将SDF-1安全有效地应用到牙髓再生治疗中仍有待阐明。
    除了SDF-1还有众多的细胞因子如血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、粒细胞集落刺激因子等直接参与血管新生。这些细胞因子可以促进牙髓血管生成因子的表达和释放，并在炎症和低氧的环境下得到增强。它们可通过与内皮细胞表面的相应受体结合从而促进其增殖、迁移、侵袭，也可使牙髓干细胞分化为内皮细胞等，此外还可诱导细胞归巢，这些作用最终都促进炎症状态下牙髓组织的血运重建。
    目前，虽然对牙髓血管生成的过程有了一定的了解，但仍有许多与细胞因子的调节、信号通路等相关的问题有待进一步研究，实现牙髓血运重建甚至牙髓再生并最终应用于临床，还需要进一步的探索。