低龄儿童龋病相关口腔菌群动态变化的研究进展

    低龄儿童龋（early childhood caries，ECC）是指6岁以下儿童口腔中发生的任意乳牙龋病，具有患病率高、发病时间早的特点。据第四次全国口腔流行病学调查显示，中国5 岁年龄组的乳牙患龋率达到71.9%，龋均达到4.24，较10 年前均有显著升高。乳牙患龋率与恒牙患龋风险相关，乳牙患龋率越高，第一恒磨牙患龋风险越大。因此，ECC 的防治仍是我国一项亟待解决的公共卫生问题。
    ECC 的病因是多因素和复杂的，涉及环境、行为、社会经济和生物因素，其中口腔微生物的存在与龋病发生密切相关, 是其主要病因。以往研究认为龋病是多种特异性致龋微生物共同作用的结果，生态菌斑假说的提出更新和扩展了龋病的内涵，认为其是口腔微生态平衡被破坏的一种病理表现。如今基因组学的高速发展为破译生物膜中的复杂生态和微生物相互作用提供了重要的技术。学者们发现ECC 相关口腔菌群在时间和空间上呈现出一定的变化规律，这将为龋病的监测和预防提供重要依据。本文将针对相关研究现状进行综述。
    1.龋病与口腔微生物群
    1）龋病相关口腔微生态
    牙齿萌出后，口腔各部位包括黏膜、牙齿和所有龋坏组织中都会有微生物定植并形成新的、独特的口腔群落，牙菌斑和唾液是学者研究口腔微生物群的常见部位。生态菌斑学说认为牙菌斑生物膜是龋病发病的重要致病因素。在成熟菌斑中，各种微生物彼此相邻或混合在一起形成特殊的复杂的微生物群落，细菌代谢产酸，进而导致牙体硬组织脱矿形成龋病。除此之外，唾液可直接影响龋病的发生和发展状态。
    一方面，唾液中的蛋白质在细菌粘附、定植牙面和形成牙菌斑的过程中发挥重要作用；另一方面，它可通过直接或间接抗菌作用等多种防御机制对抗龋病的发生。因此，菌斑生物膜和唾液蛋白质组的特异性变化将有助于鉴别龋病高危人群，研究菌斑和唾液中的微生物变化可帮助预测ECC 的发生风险。
    2）龋病相关“核心微生物组”
    人类口腔至少存在179 属645 种微生物，其中大部分是不能培养的。研究证实，健康人口腔中大部分微生物组成是相同的，主要包括链球菌属、普雷沃菌属、嗜血杆菌属和罗斯菌属等12 个属在内的健康口腔核心微生物组，这些微生物群落的结构紊乱、生态失衡可导致龋病的发生。根据微生物的致病特点，可将目前被发现的与龋病相关的“核心微生物组”分为以下几类，它们可能作为龋病防治的生物标记物。
    经典“致龋微生物”：变形菌门是细菌中最大的一门，其中变形链球菌群（Mutans Streptococci,MS）在龋齿病因学和发病机制中发挥重要作用。MS 是一种以其产酸性、耐酸性和利用碳水化合物合成细胞外基质的能力而闻名的细菌，具有感染和定植牙齿的独特能力，并在蔗糖存在的情况下通过产生不溶性葡聚糖促进致龋生物膜的发展。婴幼儿可通过其照看者的口腔垂直传播或通过其他方式水平传播而感染MS。
    在ECC 发生发展过程中，不同基因型的变异链球菌所占菌群的比例不同，有研究表明MS 的早期定植会提高儿童患龋风险，且其基因型越丰富，致龋能力越强。除MS 外，非变异链球菌属、乳杆菌属、放线菌属和双歧杆菌属等其他产酸和耐酸细菌也可以通过增强生物膜环境的酸化来促进龋病的发生。由于这些细菌大部分不能产生不溶性葡聚糖，因此它们可能不会促进龋齿生物膜基质的结构形成，但伴随着生物膜的成熟，变异链球菌很可能是生物膜基质形成的启动器，它为其他致龋细菌占据主导地位铺平了道路。
    随着对微生物群研究的深入，关于变异链球菌毒力表型、毒力相关基因的表达和遗传特征与龋病发生发展的关系仍需要我们进一步探索，而以MS 为代表的致龋菌理论也尚不能阐明龋病与微生物间的复杂关系。其他耐酸致龋细菌：在ECC 患儿的牙菌斑中还可发现一些对酸不敏感的耐酸致龋微生物，它们在致龋过程中是否发挥作用值得我们关注。其中，普雷沃氏菌属、韦荣球菌属等常存在于ECC 患儿的牙菌斑中，与牙本质龋病相关。
    普雷沃菌属具有中度耐酸能力，可与其他细菌通过竞争或协同作用发酵产生乙酸和少量乳酸，被认为是牙周病和龋病的优势菌属。韦荣球菌属与链球菌属在促进生物膜形成、细菌间黏附聚集和代谢方面有协同促进作用，但其具体机制尚不清楚。虽然它们不是主要的产酸菌，但其可利用几种产酸菌产生的乳酸作为碳源来支持它们的生长与存活，关于它们是否促进龋病的发生发展仍有待探索。
    白色念珠菌（Candida albicans, Ca）：是一种常见的机会致病菌，在ECC 患儿的菌斑生物膜中也经常被大量检测到。Ca 具有黏附牙面、产酸耐酸、产糖、溶解胶原等特性，它虽无法直接导致龋病的发生，但其可与变异链球菌、格氏链球菌、乳杆菌等其他菌群在彼此的黏附、代谢、毒力等方面表现为协同或促进作用。因此，在ECC 背景下的口腔微生物组研究中除细菌外还应包括真菌等微生物，并在未来的纵向研究中深入探究其在龋病的发生、进展和复发中的作用是必要的。
    2.ECC 相关微生物群落的时间变化
    人类口腔中不同生态位点定植的微生物群落有所不同，而且口腔微生物群落的定植会随着年龄和乳恒牙列的变化发生动态变化。口腔微生态的紊乱可表现为菌群多样性改变和群落结构的变化。在龋病发生、发展过程中及治疗前后，口腔微生物群落可发生相应的变化。这种菌群的变化可能早于临床表现，且菌群与龋病临床表现的相关性在龋病发生阶段大于患龋之后，探寻其动态变化规律将有助于我们监测龋病的发生与否。
    1）ECC 发生过程中微生物群落的多样性变化存在争议
    微生物群落多样性分析可用来估计环境群落的物种丰度和多样性，并反映样本间的相似度和差异，学者对ECC 和健康无龋儿童口腔微生物群落的多样性差异进行了研究，所得的研究结果各异。Gross 等分别对36 名ECC 儿童和健康儿童牙菌斑进行16S rRNA 基因检测，发现牙菌斑细菌的多样性在龋病发生发展过程中有减少的趋势，这可能是由于一些高度产酸、耐酸的菌群通过拮抗作用淘汰掉某些对酸敏感的细菌，从而导致物种丰富度和均匀度下降。
    而孙同正等利用罗氏454 测序平台分别对24 名ECC 患儿与无龋儿童唾液微生物群落进行研究，发现唾液细菌的多样性在龋病发展过程中增加。Jiang 等和Tang 等分别基于16SrRNA 基因测序技术和宏基因组学鸟枪测序法发现患龋与无龋儿童唾液微生态中只有某些菌群丰度存在差异，其多样性无明显差异。Kann 等的研究表明遗传因素在口腔微生物群落的早期定植、患龋后菌群构成及多样性方面起重要作用。
    这些研究均证实龋病发生过程中微生物菌群会发生一定变化，但其多样性如何变化存在较大争议。这可能与口腔微生态环境的复杂、样本人群饮食生活差异、国内外研究方法和测序技术的不同有关，因此仅基于菌群多样性的研究尚不足以预测龋病的发生及发展。
    2）ECC 发生过程中伴随更多低丰度微生物群落的增加
    ECC 儿童和无龋儿童口腔中可出现相同的优势菌门。张倩霞等通过16S rRNA 基因测序分析发现ECC 和无龋儿童光滑面龈上菌斑微生物群落优势菌门组成相似，主要包括放线菌门、变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和梭杆菌门等，这些菌门在两组中相对丰度可达到 93% 以上，被认为是在门水平上的龈上菌斑核心微生物群。
    阮文华等通过研究两组儿童的唾液微生物组成也发现了同样的优势菌门，但这些高丰度的门在各自组内的占比不同。这提示口腔中可能存在核心微生物群维持其生态环境的稳定，当这种平衡被打破时便可导致龋病的发生。研究也表明ECC 儿童口腔微生物群落结构在不同分类和功能水平上与无龋儿童相比呈现显著差异，且更加复杂。Grier 等通过监测儿童健康、龋前到龋活跃三种状态下唾液菌群的变化，发现棒杆菌属、月形单胞菌属、金氏菌属、未分类假单胞菌属、胶红酵母菌和小韦荣氏球菌在各时间点显示出轻微的差异，提示它们可能是口腔环境从健康向龋齿状态发展的早期和持久的生物标志物。
    Kanasi等的研究发现金氏菌属和龋齿罗氏菌属在ECC儿童牙菌斑中相对丰度升高，其中，金氏菌属可能在牙菌斑生物膜的形成方面起着重要作用，而龋齿罗氏菌属的数量有利于预测龋病的进展。以上这些物种均以相对较低的丰度存在于口腔菌群中，但其常伴随ECC 的发生而增加，深入研究其分布和致龋机制将有助于探究其作为龋病生物标志物的潜能。
    3）ECC 治疗前后及龋病复发过程中常伴随微生物群落变化
   龋病治疗后有较高的再患龋风险，关注ECC发病或进展过程中口腔微生物群的变化，可以建立预防ECC 发生的生物标志物方法，但目前对ECC复发过程中的菌群变化研究很少。Klinke 等的研究发现龋病治疗后牙菌斑总体丰度及变异链球菌、乳酸杆菌和念珠菌数量明显减少，但这种变化并不是永久的，随着治疗后龋齿的复发，这3 种微生物的数量再次增加。因此，治疗前高水平的乳酸杆菌可预测龋齿复发，治疗后1个月收集的龈上菌斑可用于预测复发的风险。
    Zhu等的研究发现唾液梭杆菌属、普雷沃氏菌属、纤毛菌属和二氧化碳嗜纤维菌属与ECC 复发的发病机制和进展有关，利用这四种细菌属的相对丰度及其组合来预测ECC 的复发具有良好的准确性。Garcia 等的研究表明变异链球菌表面的胶原结合蛋白（collagen-binding protein, Cbp）可与富含胶原的牙本质紧密结合，Cbp+ 变异链球菌和白色念珠菌可通过建立顽固的生物膜参与龋齿的复发过程，而副溶血性链球菌也以绝对的优势出现在龋齿的复发过程中。
    由此可见龋病治疗前微生物群落的持续存在是龋齿进展的原因，成功的治疗也伴随着微生物群的变化。此外，糖摄入频率和微生物组之间的相互作用也在儿童由健康状态向复发状态的转变中发挥重要作用。
    总之，在ECC 复发过程中口腔微生物群发生了什么变化，或者ECC 复发是否反映了可能在初始阶段就存在的特定感染。探索这个问题将有助于我们在合适的时间采取适当的预防措施，以及监测和预测初治后ECC 的复发。
    3.ECC 相关微生物群落的空间变化
    龋病是由正常牙面逐渐发展成为浅龋、中龋和深龋的动态过程，特定生境核心微生物群组成和数目的异常是微生态菌群失调的主要表现。在龋病发生发展过程中，特异性位点的菌群结构常变得更为单一，龋坏牙本质的菌群多样性最低。
    1） ECC 在不同龋坏牙面优势菌群不同
    Fakhruddin 等首次对ECC 儿童牙合面和邻面不同位点的菌群进行分析，发现牙合面龋中最常见的是极小阿托波氏菌，邻面龋中主要是大量产酸耐酸菌，且邻面龋损部位微生物多样性更高，这可能与两个部位解剖结构和所处的生态环境不同有关。
    2）ECC 在龋病发生发展进程中的特异性位点菌群分布不同
    Mark 等在健康牙釉质表面和龈上牙菌斑中检测到大量马氏棒杆菌，它可和其他致龋菌形成微生物复合体，并利用其他微生物产生的乳酸来提高生物膜的PH 值进而对龋齿的发生起到保护作用。在龋病的初始阶段，即龋白斑处常可检测到放线菌属和棒状杆菌属的存在，表明它们在龋病的起始阶段发挥重要作用。
    在龋病进展到牙本质层时，链球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、奈瑟菌、普氏菌常成为优势菌。变异链球菌属随着龋病的进展，检出率也显著增加，进一步证明了其在龋病发生发展过程中的重要作用。最近研究发现双歧杆菌的一个属-韦格斯卡多维亚菌（Scardovia Wiggsiae, S. wiggsiae）可与变异链球菌联合出现在深龋病变中，推测其在龋病发展后期发挥推动作用。
    在深龋近髓病变和暴露的髓腔中，厚壁菌门成为优势菌，与患有不可逆性牙髓炎的恒牙深龋洞主要菌群相似。这提示口腔微生物群在龋齿病变过程中往往具有阶段特异性。除细菌外，真菌在龋病进展阶段也发挥着重要作用。Ca 常在ECC 和老年根面龋中被检测到，已被证实在龋病进展中具有关键致龋毒力，它可以侵入牙本质小管，与变性的胶原蛋白结合，并分泌出天冬氨酸蛋白酶降解牙本质胶原纤维，从而导致牙齿硬组织脱矿。然而一些研究并未发现其与龋病组织相关，这可能与取样部位、取样方法、鉴定方式不同有关。都柏林念珠菌的数量也随龋病发展增加，研究证实它可能是比Ca 更好的ECC 潜在指示菌。
    然而，这些与健康相关的真菌类群也具有通过产生木糖醇和抗菌化合物来拮抗变异链球菌等致龋菌的潜力，提示其对维护口腔健康有重要作用。综上所述，龋病不是特异性致病菌引起，而是口腔微生物群落结构紊乱、生态失衡的结果。在ECC 发生发展过程中、龋病治疗前后和特异性位点的菌群多样性及结构变化复杂多样，目前关于ECC 相关菌群的纵向研究较少，尚未找到一种高度敏感的龋病生物标志物。
    随着分子生物学技术的发展，未来可结合宏基因组学、蛋白质组学和代谢组学等技术探索龋病的发病机制，深入研究微生物在龋病发生发展中的作用，了解口腔微生物连续动态变化的全貌，探寻更加敏感、准确的方法以评估儿童龋易感性和预测龋损的发展并为龋病诊断和防治提供新方法。