牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)是牙周组织中重要的干细胞来源，具有增殖能力并在特定介质中分化为不同类型的组织，如骨、脂肪、肌肉、肌腱、血管、视网膜相关组织和牙齿相关组织等。因此，PDLSCs不仅成为口腔组织还成为其他体细胞组织再生医学的细胞库。然而，在体外培养条件下，将PDLSCs定向分化为完全成熟和功能齐全的细胞类型仍然是再生医学的难题。
近年，研究发现机械刺激可以改变表观遗传起到影响干细胞分化方向的作用，并与生化刺激一样，可以有效地诱导基因型的改变。而PDLSCs与其他来源的干细胞不同的是，它包绕牙根，连接牙槽骨，在咬合时受到咀嚼力的作用，在正畸治疗中受到正畸力的作用，而这种机械应力也是PDLSCs参与牙周组织更替必要条件，因此机械刺激成为诱导PDLSCs向不同方向分化的研究热点。
机械刺激是一种物理刺激，它包含了机械力和生物材料的机械性能所产生的刺激，机械力也可以称之为机械应力，它包括压应力、牵张应力、流体剪切应力、超声等，而生物材料的机械性能包括机械弹性以及表面形貌等。研究表明，机械刺激不仅影响干细胞的生长和分化，也影响其粘附和迁移能力，明确机械刺激对于干细胞的作用及其机制有助于组织工程中干细胞谱系特异性分化策略的设计。本综述概述了机械刺激对PDLSCs细胞生物学行为的影响以及不同的时间维度下的影响效果，旨在为组织工程中PDLSCs分化调控提供参考。
1.不同机械力刺激下对PDLSCs生物学行为的影响
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)能够感知机械信号并将其转化为相应的细胞行为。各种机械力，包括张力、压缩力、流体剪切应力以及低辐高频振动波等，都已被报道影响MSCs 的体外成骨分化能力。PDLSCs是参与牙周组织再生的主要MSCs类型之一，其在体内的主要功能是再生牙骨质和牙周韧带。
然而牙周韧带不仅在牙槽骨上锚定牙齿，而且在牙萌出、咀嚼过程中的生理活动和牙槽骨重塑中发挥重要作用，不断受到由发音、咀嚼、口腔治疗等产生的生理或治疗性机械负荷的影响。事实上，牙齿无咬合、牙周组织废用会导致牙周韧带萎缩和牙槽骨吸收，显然PDLSCs在这一过程中起到了关键作用，提示其具有较高的机械敏感性。
1.1 压缩应力和牵张应力对PDLSCs的影响
牙移动是口腔正畸治疗的一个基本现象，即在持续、适当的矫治力作用下，错位牙在牙槽骨中逐步发生定向移动。牵张力和压缩力是正畸牙移动过程中力的两种表现形式。
正畸牙移动过程中，PDLSCs能够感知压缩应力并将其转化为生物信号从而促进牙槽骨重构。Wu等利用四点弯曲加力装置将牙周膜细胞施加循环压应力，发现其增殖迁移受到抑制，并且这种抑制具有时间依赖性，在12h内随时间增加而增强；同时压应力的大小也会影响PDLSCs的细胞状态。
Panchamanon等对PDLSCs施加不同大小的静态压缩力，发现压应力影响PDLSCs的干性，在施加1.0g/cm2的压缩力显著上调了包括NANOG和OCT4在内的干细胞标记基因，而较大的力量会下调这些基因表达。在压应力的作用下，PDLSCs通过增加自噬，介导细胞器降解和循环来维持细胞内稳态。
适当的压应力诱导PDLSCs自噬，而当压缩力为4.0g/cm2 时，PDLSCs会发生部分损伤，可能与自噬反应受损有关，对自噬的研究有助于确定正畸牙齿移动时的最佳受力。这些现象可以解释正畸治疗牙移动过程中，牙周组织受压侧发生骨吸收这一生理现象。
此外，压缩应力能促进PDLSCs的成骨分化，这种作用随着受压时间的延长而减弱。Zhang等将PDLSCs暴露于水压1h后，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性和成骨相关转录因子Runx2/Sp7 的表达上调，促进了PDLSCs成骨分化，而这种影响在压力暴露12h后显著减弱。
在机械刺激后，Wnt/β-catenin通路在PDL和PDLSCs中被动态激活，激活的Wnt/β-catenin通路通过调控成骨相关转录因子参与成骨，并通过控制基质细胞分泌RANKL/OPG诱导破骨细胞发生，从而参与牙周组织重塑，维持牙周环境稳定。
Huang等对压缩应力施加12h后的PDLSCs的长链非编码RNA和信使RNA表达谱进行了研究，发现受压后的PDLSCs的成骨分化降低，与正常细胞相比，有90个长链非编RNA和519个信使RNA在压缩后的PDLSCs中有差异性表达。这提示在短时间压缩应力刺激下促进PDLSCs成骨分化，而长时间的压缩应力刺激后的成骨分化会出现抑制。
现有研究证实牵张应力能够作用相关靶基因促进PDLSCs成骨分化。赵艳等对体外培养PDLSCs分别施加不同强度的静态牵张力，连续加力12h后成骨细胞标志物的水平随加载时间而明显升高，静态牵张力显著促进了PDLSCs成骨向分化，其中8%静态牵张力更有利于其细胞生物学潜能的发挥。
Lv等证实机械牵张力诱导的外泌体通过上调微小RNA-181b-5p表达，靶向磷酸酶张力同源物缺失(phosphatase tension homolog deletion，PTEN)/AKT通路促进PDLSCs增殖，并通过BMP2/Runx2促进PDLSC成骨分化，提示其可能是维持牙周稳态的机制之一。此外，研究显示动态牵张力相较于静态牵张力似乎有更好的促成骨作用。
Wang等发现周期性牵张力以频率依赖的方式促进PDLSCs的成骨，在0.3~1.0Hz的周期性机械牵拉下，Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor2，RUNX2)、Ⅰ型胶原(collagen-Ⅰ，COL-Ⅰ)和骨钙蛋白(osteocalcin，OCN)表达上调，其蛋白表达水平随牵拉频率的增加而升高，在0.7Hz时达到峰值，而后有所下降。
1.2 流体剪切应力和低辐高频振动波对PDLSCs的影响
在言语、咀嚼过程中，压力在牙齿和牙槽骨之间累积时，加压的间质液在牙周韧带细胞膜上产生流体剪切应力(fluidshear stress，FSS)。剪切应力是牙齿和牙槽骨之间通过扭转和剪切产生的，是诱导牙周组织更替最常见的机械应力类型。Zheng等利用平行板流式产生流体剪切应力，发现FSS影响了PDLSCs增殖和迁移，在施加4h6dyn/cm2的FSS时促进了PDLSCs增殖但抑制其迁移能力。
研究发现FSS抑制PDLSCs迁移能力是通过调控血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor receptors，PDGFR)的表达实现的。PDGF受体(PDGFR)-α和β的基因和蛋白表达均在FSS作用下降低，而激活PDGFRs拯救了FSS抑制的迁移。
除了牵张力、压力、流体剪切力外，一些学者还使用低辐高频振动波(low-magnitude，high-frequency，LMHF)或低强度超声波(low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS)实现了对PDLSCs成骨分化的促进。Li等使用LIPUS处理PDLSCs 30min，诱导7d后，显微镜下观察到LIPUS处理组细胞连接紧密，呈多层生长，形成细胞片，并且成骨相关基因蛋白表达也明显上调。
Zhang等发现当LMHF加速度大于或等于0.3g时，PDLSCs增殖显著，COL-I蛋白水平在0.3g时达到峰值，而肌腱相关蛋白基因Scleraxis 0.9g时达到峰值。然而在成骨相关基因表达上升时，成肌腱相关基因表达下降，反之亦然。这一现象提示LMHF的幅度变化影响PDLSCs的分化方向，PDLSCs的分化具有较高的机械敏感性。
1.3 机械力诱导PDLSCs的多向分化
近几年越来越多的研究发现机械刺激还具有促进PDLSCs向口腔以外的其他体细胞分化的作用。PDLSCs与角膜基质角细胞和角膜内皮细胞具有相似的颅神经嵴起源和蛋白多糖分泌，这为PDLSC分化为角膜细胞提供了可能性。Chen等利用Flexcell系统对PDLSCs施加圆顶状机械刺激，促进了PDLSCs向角膜基质细胞分化，并与诱导培养基具有协同作用。
在诱导培养基和机械刺激的双重作用下诱导PDLSCs产生角膜基质样细胞片，其平均透光率超过90%，高于人类角膜。PDLSCs的这种特性在未来眼科临床治疗中具有很大的潜力。然而，PDLSCs受到单纯的机械刺激向其他体细胞如腱细胞分化并不能达到很好的效果，而力学因素与生长因素的结合，或力学、生长因子和氧张力的结合或共培养能够更好地促进其向目标细胞分化。
心肌细胞作为存在于人体内最具活力环境中的细胞，在搏动的血液流动中不断暴露于高水平的机械拉伸应力和剪切应力中。Pelaez等学者在特制的细胞反应器内对PDLSCs施加短期动态机械张力，仅2h的机械刺激就引起了PDLSCs心肌生成反应，激活了核易位心脏特异性转录因子GATA4、MEF2C和Nkx2.5，诱导肌动蛋白和心肌肌钙蛋白T的表达。这提示了PDLSCs具有多向分化能力，并且机械刺激具有作为PDLSCs心肌形成的诱导因子潜能。
2.细胞培养基质的表面形貌和弹性对PDLSCs生物学行为的影响
2.1 细胞培养基质的表面形貌对PDLSCs的影响
在组织学观察中，牙周膜是一个高度定向的组织，包含平行的纳米级胶原纤维。这种纳米纤维生态位即表面形貌通过其结构和分子组成在调节组织功能、细胞性能和分化方面发挥了重要作用。一项关于基质形貌的研究发现，小而圆的几何线限制了MSCs的生长，相反，更大的基质几何形状促进细胞扩散并向成骨细胞分化。面积本身并不是基质形貌的关键参数，而是其纵横比(宽长比)。研究观察到纵横比高(但面积相同)的几何形状促进MSCs成骨，这可能是由于肌动球蛋白收缩从而促进细胞成骨。
PDLSCs通过调节粘附、细胞骨架张力和PDZ结合基序的同源转录共激活因子TAZ的核激活来感知和响应表面纳米形貌。此外，Kim 等通过将这些纤维生态位转化为受控的细胞培养基质特征，研究了机械-表面结构联合刺激对PDLSCs形态、排列增殖、成骨分化的影响，发现机械刺激和基质的纳米结构对牙周组织成骨分化具有协同作用。
2.2 细胞培养基质的弹性对PDLSCs的影响
研究表明，可以通过改变细胞培养基质的弹性模量，调节干细胞的行为。在弹性水凝胶的培养基中，PDLSCs对水凝胶的弹性很敏感，软脑模拟基质触发神经发生，硬肌样凝胶诱导肌发生，刚性结构模拟胶原骨基质诱导成骨。Hegedús等通过调节交联比例建立了不同硬度的聚天冬酰胺(PASP)基水凝胶，结果发现较硬的凝胶表面和游离硫醇的存在有利于PDLSCs的粘附和成骨方向分化。
该实验还发现，PDLSCs在软凝胶(0.1~1kPa)时表现出神经源性分化，而较高的刚度(8~17kPa)时表现为肌源性方向分化，在刚性基质(25~40kPa)时出现了最佳的成骨分化。Yan等学者发现聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)基质可促进PDLSCs的快速体外扩增，且不影响细胞的自我更新能力，并且在同一供体中，与软PDMS组相比，硬PDMS基质增加了PDLSCs的成骨基因表达。
值得注意的是，在一定时间的机械刺激下，PDLSCs可以保留过去培养环境中的弹性信息，并影响其未来的分化方向。He等采用明胶甲基丙烯酸酯水凝胶制备了不同刚度的基板，分别在不同刚度的基质上培养PDLSCs，并将一半的细胞在第4代时交换了不同刚度的基板。
通过荧光染色观察PDLSCs的形态和YAP 在细胞内的定位发现PDLSCs的形态和YAP位置和成骨活性在基质改变组和不变组之间存在差异，说明细胞形态在适应基质的改变。细胞内YAP的激活程度的变化与细胞形态的变化有相似之处，随着在软基质上培养时间的延长，硬-软组细胞的YAP活性逐渐降低，这种机械记忆逐渐消失，但是与其他MSCs相比PDLSCs的YAP对基质刚度的反应相对较弱。
3.机械刺激影响PDLSCs生物学行为的机制
机械刺激主要通过两部分的信号转导来影响PDLSCs生物学行为的，第一部分是机械刺激在细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的信号传导，第二部分是机械信号向细胞核内的传导，这两部分相互影响并最终影响干细胞增殖、分化、干性以及细胞骨架的重组。
3.1 机械信号在ECM 向细胞质的传导
机械刺激在细胞外基质的信号传导可以通过离子通道、跨膜耦联受体、整合素以及钙粘蛋白，其中关于PDLSCs的机械信号传导主要集中在整合素和离子通道。
整合素由α和β两个亚基组合而成，α和β亚基构成了24种不同的异源二聚体受体，因此ECM 部分受体与配体结合的亲和性具有高度的选择性，说明细胞对环境压力做出适当反应的能力具有高度的特异性。整合素促进细胞内黏着斑复合体(focal adhesion complexes，FACs)的形成，FACs通过构象改变从而暴露张力敏感的结合位点，允许机械力在ECM 和细胞内细胞骨架之间双向传递。
细胞骨架主要由肌动蛋白、微管和中间丝组成。细胞骨架作为细胞膜和染色体之间的连续结构，为细胞提供了结构框架。这一过程受到Ras同源蛋白家族成员A(RhoA)和Rho-相关蛋白激酶(ROCK)活性的影响。RhoA通过下游的蛋白磷酸化级联反应来调节FACs、肌动蛋白和肌凝蛋白的收缩性，进而调节细胞骨架张力。有研究发现LMHF 机械刺激后，PDLSCs中的F-actin纤维变得更清晰、更粗。此外，细胞骨架重塑的水平影响PDLSCs的机械驱动成骨，这与施加的振动刺激的大小相关。
压电蛋白是一种兴奋性机械敏感离子通道的成孔亚基，研究表明，它们在各种真核细胞类型中诱导机械激活的阳离子电流，将机械力与细胞信号联系起来。压电蛋白使细胞能够通过允许正电荷离子(如钙离子)转移到细胞中以响应机械刺激来感知力。
有研究发现LIPUS通过激活Piezo1促进hPDLSCs内皮分化和微血管形成，然而Gao等的研究观察到Piezo通道与LIPUS刺激的rPDLSC增殖无关，但其抑制剂降低了LIPUS诱导的PDLSCs中磷酸化的JNK/p38/MAPK水平。此外，静态压缩应力2.0g/cm2 作用于牙周膜细胞时，Piezo1抑制剂通过下调p38/ERK1/2信号通路可减轻牙周膜细胞的凋亡和损伤。
瞬时受体电位(TRP)钙通道是一种典型的机械敏感通道，在各种类型的组织和细胞中参与不同刺激的感觉。TRP亚家族V成员4(TRPV4)调节机械感觉、炎症和能量稳态。Jin等的研究发现在压缩应力作用下PDLSCs中TRPV4的激活有助于改变其干细胞特性，并且PDLSCs中TRPV4的力诱导激活通过ERK信号通路影响RANKL/OPG系统来调节破骨细胞分化。
3.2 机械信号在细胞质向细胞核的传导
细胞在检测到机械刺激后，通过力学感受器传递到细胞质，进而传递到细胞核，促进基因和蛋白表达谱的改变，从而驱动细胞行为响应。Yes相关蛋白(YAP)及其与PDZ结合基序的同源转录共激活因子(TAZ)在核信号转导中的活动和作用与细胞内定位密切相关。
YAP/TAZ主要有两个信号分支：第一，Hippo途径：钙粘蛋白和反式钙粘蛋白相互作用导致YAP滞留于细胞质中；第二，机械敏感途径：细胞骨架张力促进YAP核移位和下游转录活动。在细胞质中，YAP/TAZ处于非活性磷酸化状态，被蛋白酶降解在细胞质内，当YAP/TAZ转化为一种有活性的去磷酸化状态时，调控细胞增殖、干性以及分化。
研究表明YAP/TAZ在细胞内的定位可能受机械刺激的影响，并参与其介导的细胞行为调控。Hwang等报道，纳米管的形貌激活了丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)通路，从而增加了TAZ的核转位。Hu等学者对基质表面形貌的研究结果表明，钛表面分级微槽/纳米材料会引发肌动蛋白细胞骨架聚合和MAPK信号通路激活，引起了TAZ激活，从而影响了PDLSCs的分化。此外Wang等发现循环拉伸应力可以通过影响TAZ的核定位，进而调控PDLSCs的成骨分化，TAZ的核累积显著促进其成骨能力。
4.总结与展望
干细胞是位于身体不同部位的未分化细胞。干细胞的主要作用是修复受损组织，其主要来源是骨髓。口腔组织是干细胞的新来源之一，口腔干细胞具有很强的自我更新能力、间充质干细胞特性、多谱系分化和免疫调节功能，在短期和长期低温保存后，能够保持其多能性，在体内外分化研究和免疫相关疾病的治疗中具有广阔的应用前景。
牙周组织在正常咀嚼过程中以及病理性创伤或正畸牙齿移动过程中都会受到机械应力的影响，相较其他类型口腔干细胞，PDLSCs更易受到下颌运动和咬合力产生的较高水平的口腔机械应力，受到更多的机械刺激，因此机械因素越来越被认为是PDLSCs行为和功能的关键调节因素。大量研究证实，机械刺激不仅能够调控PDLSCs向成骨方向分化，还能促进其向角膜基质细胞和心肌细胞等体细胞方向分化。
PDLSCs的这种机械反应性表明这些细胞可以用于骨组织工程、心脏再生、角膜再生等应用。再生医学是PDLSCs的重要应用，这需要机械生物学的全面知识。目前研究已证实PDLSCs的机械刺激信号可以通过整合素和离子通道传递至细胞内，进而调节细胞行为。对调节PDLSCs行为的机械刺激的了解不仅可以提高我们对其分化机制的认识，而且还可以为优化基于PDLSCs的治疗提供有价值的见解。
事实上，PDLSCs对机械刺激的特殊反应可能在未来的骨骼和牙齿组织工程应用中有实用价值。虽然已知物理和机械因素在调节PDLSCs命运中起着关键作用，但需要进一步研究来阐明PDLSCs对各种类型力的机械敏感反应所涉及的详细分子机制和信号通路。
