口腔癌在狭义上被定义为口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC），因为90%的口腔恶性肿瘤的病理分型是鳞状细胞癌。我国属于OSCC发病率较高的国家，根据Yang等2021年发布的报告估计：1990—2017年，我国口腔癌新发病例数和年龄标准化发病率分别增长280.0%和79.7%；死亡人数和年龄标准化死亡率分别上升了196.8%和29.0%。
OSCC最重要的扩散机制就是发生颈部淋巴结转移。在早期（cT1-2N0） OSCC中约有50%的患者会发生颈部淋巴结转移，20%~30%的患者有隐匿性淋巴结转移，一旦发生则会使患者的生存率降低约50%。OSCC的治疗及预后在一定程度上取决于颈部转移性淋巴结的早期诊治，而选择可靠的影像学检查手段至关重要。
常规超声检查是目前临床上检查颈部淋巴结的首选影像学方法，已被普遍应用于检查颈部转移性淋巴结，且具有比电子计算机X射线断层扫描技术（computed tomography，CT）和磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI） 更好的分辨率，但是良恶性淋巴结的超声表现存在重叠及交叉，并且对于直径较小或者位置较深的淋巴结的诊断存在一定的假阴性率。
随着超声影像诊断学的不断发展，超声造影（contras-enhanced ultrasound，CEUS） 成为近年来超声医学领域的革命性技术，它可以更加便捷、实时、无辐射地评价组织器官血流灌注情况。研究表明在浅表淋巴结良恶性的鉴别诊断中CEUS显示的淋巴管微血管优于常规超声，同时诊断的准确率也高于常规超声。
目前CEUS主要用于鼻咽癌及甲状腺癌等的颈部转移性淋巴结的诊断，但在OSCC颈部转移性淋巴结方面还处于研究及探索阶段。本文就CEUS在OSCC颈部转移性淋巴结诊断中的研究进展进行综述。
1.CEUS 概述
1.1造影原理
CEUS是以常规超声检查为基础发展起来的，通过将与人体软组织之间有明显不同声阻抗的造影剂注入检查脏器，造影剂在组织中会随着血液流动，期间与超声波相互作用而出现多种复杂效应。相较于血细胞或周围组织，造影剂以非线性共振为主的运动能够提高脏器组织血流背向散射的信号强度，获得对比增强图像使得器官或病变易于观察对比，从而完成疾病的鉴别诊断。
1.2造影剂
造影剂是CEUS检查的基础，它是在医学超声造影成像中所使用的药剂，一般是由内含气体的微米级气泡组成，故也称之为微泡。其最早的临床应用可追溯于1968年Gramiak等在心导管插入过程中注入含有少量气泡的生理盐水溶液后，在超声心动图中观察到主动脉内有造影增强信号，由此提出了超声造影剂的概念。从发现超声造影现象至今，造影剂的研发已经历了3代。
第1代造影剂是含有混合空气或CO2的微泡，其缺点是无外膜且直径大，不稳定容易破裂，无法通过肺循环且存留时间短，因此仅被用于心脏造影。第2代造影剂是以蛋白质或脂质作为外壳，内包裹空气的微泡，虽然可以顺利通过肺循环、左心室再经体循环使得脏器显影，但是其外膜较厚，稳定性较差。它最早用于增强淋巴结内的多普勒信号，但无法克服彩色多普勒和能量多普勒固有的局限性，只能提供淋巴结内较大血管的信息。
目前我国临床上常使用的是第3代超声造影剂，均由柔性磷脂外膜包裹氟碳类气体组成的高密度微泡，平均直径与红细胞大小十分相近，无法透过血管膜进入间质。由于气体的低溶解度和磷脂壳的稳定性，在外周血中具有较高的稳定性，进入人体后可自由通过微循环并顺利到达富含血管的脏器并且持续较长时间的成像，大多数造影微泡在给药20 min内即可通过肺部被消除。这类造影剂的代表有声诺维（SonoVue） 和示卓安（Sonazoid）。
相较于前2代造影剂，它们在稳定性、安全性及有效性方面的提高使CEUS进入了新阶段，同时也为淋巴结微血管成像奠定了基础。经静脉注入后可以顺利通过血液循环进入毛细血管和淋巴结微血管，能准确地显现出淋巴结微血管的灌注和分布，从而获取实时增强对比图像。在皮下或肿瘤周围组织注射造影微泡后，超声图像中可以显示出头颈部肿瘤的引流淋巴管及前哨淋巴结（sentinel lymph node，SLN），从而判断是否有SLN转移。
1.3检查方法
所有被检查者均应知情并同意接受检查。首先使用常规超声探头检查目标区域的浅表淋巴结并记录相应的指标，然后对可疑淋巴结行CEUS检查，切换造影探头，同时将生理盐水注入造影剂瓶中，并彻底振荡制成均匀的微泡悬液。通常经肘静脉团注或经皮注入，然后打开超声仪的定时器，用现场双图像动态成像对比分析检查区域的淋巴结，并储存造影实时动态图像。造影结束后调取图像，通过观察造影图像或使用仪器自带软件绘制灌注时间-强度曲线获得相关定量参数进行鉴别诊断。
2.CEUS 在OSCC 颈部转移性淋巴结中的应用
正常结构的淋巴结有来自于淋巴门处的门动脉的丰富血供，自淋巴门向皮质呈离心型分支状逐级分布，可见规则的动静脉血管。经外周静脉注射造影剂后，正常或反应性增生淋巴结会显示出造影剂自淋巴门向实质内离心型灌注，并快速均匀地分布于整个淋巴结。
在转移性淋巴结内肿瘤细胞首先侵犯外周的输入淋巴管、包膜下窦，然后逐步向内部实质浸润生长，同时会破坏局部微血管，使得血管受压、栓塞出现缺血、坏死，但是在肿瘤细胞生长活跃的淋巴结周边区也可持续诱导产生新血管，形成微血管网，而在淋巴结的中心区比较容易形成缺血坏死区，造影剂进入后呈现为四周向中心的向心型灌注，相比良性淋巴结会持续较长时间的对比增强，同时淋巴结实质内局部低灌注或无灌注，从而表现出灌注缺损这一重要的影像特征。
因此，与常规超声相比，CEUS可以明显增强淋巴结内的血流信号，实时动态地反映造影微泡在淋巴结内微循环灌注情况，能更加具体地显示转移性淋巴结微循环血管的分布和走向等特征，从而使得临床医师可以做出更准确地诊断。
目前CEUS在淋巴结定性分析中的增强模式分类尚无统一标准，多将其分为均匀增强型、不均匀增强型、微弱或无增强型，根据淋巴结增强类型分为向心型、离心型、混合型。研究指出转移性淋巴结的诊断标准为不均匀增强模式和向心性或混合型增强类型。OSCC颈部转移性淋巴结增强模式主要表现为不均匀增强型，增强形态为从周边开始较明显地增强，但总体分布不均匀，内部可见大小不一的低或无增强区，随即缓慢地消退。
在CEUS对53枚OSCC患者颈部转移性淋巴结的研究中发现，它们的增强模式多表现为实质不均匀增强和微弱增强，约有70.0%表现为淋巴结实质内有局部低或无增强区，约26.4%的表现为微弱增强。但实际上表现为坏死区的灌注缺损的影像特征不能认为一定是转移性淋巴结，有研究表明淋巴结结核与转移性淋巴结均可表现为不均匀增强并伴有局部灌注缺损。因为炎症、结核或其他病因也会引起坏死，所以可能会降低CEUS在评估OSCC颈部转移性淋巴结中的特异性。
CEUS可以通过分析时间-强度曲线从而获得转移性淋巴结造影的显影时间、达峰时间、稳定时间、峰值强度、曲线下面积、稳定强度等多项定量参数，但可能因为不同类型造影剂的使用剂量和注射速度、不同型号的检查机器以及被检查者自身血流动力学等因素影响，多项诊断指标仍存在差异。而目前较为统一的观点是转移性淋巴结曲线下面积大于正常或反应性增生淋巴结。
有研究发现转移性淋巴结峰值强度与良性淋巴结相比，其差异无统计学意义。2022年进行的一项包含了42 名早期（cT1-2N0） OSCC患者的研究表明：颈部转移性淋巴结峰值强度显著低于良性淋巴结，同时也指出CEUS对颈部转移性淋巴结诊断准确率为82.9%，而常规超声的准确率仅为67.1%，远低于CEUS。
3.CEUS 与其他检查对OSCC 颈部转移性淋巴结诊断的比较
OSCC颈部转移性淋巴结的评估对手术方案的制定、术前或术后辅助放化疗、肿瘤分期以及预后具有重要指导意义。当前临床上常用检查OSCC转移性淋巴结的其他影像学方法主要有CT、MRI和正电子发射计算机断层显像（positron emission tomography-computed tomography， PET-CT） 等。CT、MRI等临床常用的检查方法通过对淋巴结的大小、内部结构及包膜的改变等形态学特征来诊断，但对于早期隐匿性转移难以识别。
增强CT被认为是目前一线检查方式，与临床触诊相比，使用该检查能提高淋巴结分期的准确性。有研究对100例OSCC患者的颈部淋巴结进行增强CT分析，结果显示其诊断转移性淋巴结的诊断准确性为73%。在对48例OSCC患者颈部转移性淋巴结CEUS 和增强CT 的前瞻性对比研究中发现，CEUS和CECT的准确性分别为89.88%和87.16%，但是CT具有辐射性，短期内不宜重复检查。
在不同科室放射科医生对接受了增强CT和MRI的OSCC患者颈部转移性淋巴结图像分析的研究中发现，所有医生在增强CT中发现的转移淋巴结数目都比MRI多，同时MRI检查时间较长，影像易受干扰。PET-CT对于诊断OSCC颈部不同分区转移淋巴结的准确性达89.5%，高于CT/MRI，但因其检查费用昂贵目前尚无法广泛应用。
以上研究表明，CEUS对OSCC颈部转移性淋巴结诊断效率优于CT、MRI，似乎是一种更有应用前途的诊断工具，但CEUS对患者整体的病情如判断肿瘤病变位置、侵犯范围、累及淋巴结的情况及临床分期等的评估相较于上述其他检查方法存在不足之处。有研究认为：对于发现颈部转移性淋巴结来说，增强CT是不可或缺的检查方法，但若对于检查出的可疑淋巴结，完善CEUS检查能够得到更多的诊断信息。
4.CEUS 在OSCC 患者SLN 检查中的应用
在治疗OSCC的历史中，前哨淋巴结活检术（sentinel lymph node biopsy，SLNB） 在过去几十年里不断发展，从20世纪60年代开始报道的颈部淋巴结可视化的研究，到头颈部淋巴结引流图被引进，并在21世纪得到验证，继而在OSCC患者中实施，至2010年发现在只有SLN发生转移后进行颈部淋巴结清扫的研究中显示出高敏感性。
淋巴闪烁显像或放射性同位素技术是识别头颈部实体性恶性肿瘤SLN的金标准，包括术前注射放射性示踪剂和术中用外部放射性探测器定位SLN，但使用该方法对患者和医务人员都有辐射照射，需要放射科人员的协助。近年来，吲哚菁绿结合近红外荧光显影技术（near-infrared fluorescence，NIF） 成为手术中对SLN进行光学成像的一种新方法。
研究表明：吲哚菁绿在定位OSCC患者SLN时NIF识别SLN的特异度较高，但灵敏度却存在较大差异，高者可达100%，低可至50%。与NIF使用非放射性荧光染料显影SLN相似，CEUS利用了安全且无污染的造影剂微泡等回声颗粒对SLN成像来获取有关的诊断信息。
当瘤体边缘位置注射微泡后，在造影模式下即可视化注射部位的造影剂增强并实时成像、跟踪造影剂微泡通过淋巴管的运输，直至积聚在SLN中。随后，对检查区域其余淋巴结进行扫描，以寻找其他造影剂增强的淋巴结。造影剂增强的淋巴结既可以标记行SLNB，也可以直接进行手术切除或抽吸细胞学检查。
Sever等提出了应用皮下注射微泡后使用CEUS进行定位SLN的方法。目前CEUS已广泛应用于乳腺癌腋窝SLN的定位和诊断，术前定位率为90%~100%，而对于探查OSCC患者颈部SLN的研究还相对较少。
为了探究CEUS对OSCC患者SLN的诊断价值，Gvetadze等对12例早期舌癌患者进行SLN检查，发现CEUS对SLN的识别率为91.7%，且在此期间未观察到造影剂SonoVue相关的不良反应。Wakisaka等在使用Sonazoid探究OSCC患者SLN的初步临床研究中成功检测到了具有代表性的SLN，证明了CEUS引导检测SLN的临床应用价值，亦是一种可以替代放射性同位素的新方法。
国内学者Huang等对21例早期舌癌患者注射Sonazoid后立即行CEUS检查以确定SLN，证实了CEUS联合SLNB对评价舌癌患者颈部淋巴结状况有较高的准确性。因此对于OSCC来说，CEUS是一种可行的和潜在的能够应用于SLNB的方法，但是仍需要更多的临床研究来验证它的检测性能。
5.纳米级超声造影剂在OSCC 颈部转移性淋巴结中的应用
近年来，超声分子影像学得到迅速发展，新的超声造影剂也不断被研究制造出来。目前已有纳米级靶向超声造影剂在动物实验中的应用研究，相较于前述的微米级超声造影剂，纳米级靶向超声造影剂的穿透力更强，不仅可以通过被动和主动靶向机制使肿瘤血管成像，而且可以经过修饰后携带药物或基因作用于肿瘤组织，具有对肿瘤组织诊断与治疗的双重性能，因此成为了目前超声分子成像技术对颈部转移性淋巴结诊治的研究热点。
Wang等利用基质细胞衍生因子-1 （stromal cell-derived factor 1，SDF-1） 对头颈部鳞状细胞癌的特异性趋化特点，使用CXCL12-CXCR4生物轴制备了载SDF-1纳米粒造影剂并在体外研究了其超声、光声双模态显像能力。除此之外，还在体内成功建立了兔舌癌颈部转移性淋巴结模型，并在此模型上成功验证了载SDF-1纳米粒造影剂靶向趋化转移淋巴结的鳞状细胞癌细胞膜上并获得良好的显像效果的能力，为舌癌原发灶和转移性淋巴结的诊断方法和标准的建立提供了支持。
有学者研制的乙二醇-壳聚糖包覆的金纳米粒子在小鼠舌癌颈部淋巴结研究中，成功实现了该粒子的光声显像，验证了其作为造影剂用于转移性淋巴结显像的可行性，同时将肿瘤抗原传递到淋巴结内，实现了淋巴结显像和肿瘤免疫治疗的作用。到目前为止，应用纳米级靶向超声造影剂在超声分子成像中作用已经在大量的临床前研究和不同的动物模型中得到证实，各种不同靶向配体的造影剂已经被开发出来，以了解不同疾病机制的进展。
然而，其合成过程较烦琐，制备工艺相对复杂，对基因或药物的携载能力不一，因此仍需较长时间及大量资金支持进行临床试验来证明在人体的适用性， 以进一步加快临床转化。
6.总结与展望
自CEUS问世以来，它在甲状腺、乳腺、腮腺及浅表淋巴结等组织的疾病诊断中已经被证明是一种可靠技术，但关于OSCC颈部转移性淋巴结的研究及临床应用有限。虽然CEUS在OSCC颈部转移性淋巴结的诊断中提供了客观数据，提高了超声的诊断能力，对于OSCC的诊断、治疗及预后均有重要意义，但也存在一定的局限性，如其定量参数的诊断效能仍有待提高，对患者整体病情的评估不如增强CT等。
随着CEUS技术及新型超声造影剂的不断发展、更新，CEUS将会在临床上成为辅助诊断转移性淋巴结的重要手段，对于OSCC颈部转移性淋巴结的早发现、诊断、治疗将发挥更大的作用。
