生物膜(biofilm)是在介质表面由微生物群落与胞外基质相互连接形成的生态环境，所包含的细菌相互有序的生活在生物膜立体空间内，是有代谢能力的微生物群体，并置身于多糖、蛋白质和矿物质组成的基质中。
在口腔中，细菌可以黏附在生物结构和非生物结构表面，从而形成生物膜，引起严重的口腔疾病。因此，建立可靠的检测鉴定技术迫在眉睫。荧光探针由于制备简单、低成本、高灵敏度、实时检测以及时空分辨率强大的优点，在医学领域显示出巨大的潜力，其在口腔生物膜中的应用也越来越广。本文对其做一综述，希望能够对口腔中生物膜感染所致疾病提供一些新的防治策略。
1. 荧光探针概述
1.1 荧光的产生
在可见光的波长范围内，发光体分子中的原子核外电子被激发，高能级到低能级之间的热辐射，肉眼可见，称之为荧光。
1.2 荧光探针的组成
荧光探针是能够产生荧光并且能够作为染料的化合物，对光的吸收具有高度选择性，这与其分子组成有密切关系，荧光探针由3个部分组成：荧光团、识别基团和连接臂。
1.3 荧光探针的基本性质
(1)发射波长总是大于激发波长； (2)选择和鉴别可根据激发、发射光谱； (3)荧光强度决定了检测的灵敏度； (4)荧光寿命短时可以提高检测的灵敏度，长时对敏感度检测也有意义； (5)在一定的限度之内，荧光强度随着激发光强度提升而提高，激发光强度过高则影响荧光的稳定性。
1.4 荧光探针的分类
荧光探针的分类多种多样，根据材料属性分为有机和无机探针，根据待测物质分为阴阳离子、死活细胞等荧光探针，根据化学反应分为碱性、酸性、中性荧光探针等。
1.5 荧光探针的优点
随着激光共聚焦扫描显微镜(confocal laser scanning microscope， CLSM)技术的发展，荧光探针的优点日益凸显： (1)方法敏感，操作简便，实验周期短；(2)实时检测、时效性强及三维观测重建； (3)可以检测鉴定不能培养的细胞； (4)适合大规模生物细菌筛检及鉴定； (5)准确研究性质、数量、时间和位置。
1.6 荧光探针制备方法及其标记原理
在实验室使用的荧光探针大多可直接从各生物试剂公司购得，尽管方便快捷，但了解荧光探针的制备方法是有必要的，其决定了荧光探针的性能。制备方法大体分为两种：有机相中合成和水相中合成。有机相中合成较水相中合成复杂，所制备探针水溶性差，但荧光特性良好；水相中合成提高了生物相容性，可以直接溶于水，利于开展应用。
荧光探针的标记原理是将能吸收一定频率光能的基团与已知的抗体或抗原分子结合，再与对应的抗原或抗体反应，所形成的复合物就带有荧光探针。经激发后的荧光物质分子回到基态所发出的荧光，可以在检测荧光的显微镜下观测到，其所在部位即为相应的抗原或抗体。
2. 荧光探针在口腔生物膜的应用
口腔生物膜中的微生物研究，多使用实验室培养等传统方法，但能培养的口腔生物膜微生物只是少数。荧光探针的优越性与CLSM技术的结合应用，再利用计算机进行处理，从而得到微生物不同层面立体结构图像。目前，荧光探针正逐步成为口腔生物膜研究中强有力的工具。
2.1 应用于生物结构表面
牙菌斑在结构、发育上，都符合生物膜模式，是十分典型的由多种微生物组成的口腔生物膜，是大多数口腔疾病(如龋齿、龈炎、牙周炎等)的始动因子。
2.1.1 致龋性细菌
变异链球菌是口腔中的主要致龋菌，可引起牙硬组织生物膜形成，形成生物膜是其重要的毒力因子之一，不断地产酸使局部的pH值降低，造成硬组织脱矿，最终形成龋齿。变异链球菌是龋病研究的核心之一。
Pourhajibagher等从212 例患者的牙菌斑标本中分离变异链球菌，用2′， 7′- 二氯荧光素二乙酸酯(2′，7′- Dichlorodihydrofluorescein diacetate， DCFH- DA)荧光探针测量细胞内活性氧(reactive oxygen species， ROS)水平； Feng等成功将荧光萘酰亚胺衍生物设计成一种比率荧光探针，对变异链球菌葡萄糖基转移酶可灵敏、选择性的实时检测并成像。Hollmann等通过将两个pH敏感荧光团共价封装，得到比率荧光pH敏感纳米传感器，用来分析变异链球菌生物膜实时pH变化。Dunkers等使用阴离子荧光膜电压探针，开发了一种可量化的变异链球菌生存能力检测方法。
2.1.2 牙髓根尖周病致病菌
牙髓根尖周病是常见的细菌感染导致的口腔疾病。Zehnder等用6- 羧荧光素、羧基- X- 罗丹明、 Cy3和Cy5标记的特异性寡核苷酸rRNA荧光探针，检测从慢性根尖脓肿、正常根尖周组织采集的样本，获得了牙髓生物膜中的菌群分类。Pourhajibagher等研究牙髓感染治疗中微生物的情况，用DCFH- DA荧光探针测定粪肠球菌细胞内ROS的产生和变化。
2.1.3 牙周炎致病菌
牙周炎是由菌斑生物膜引起的牙周组织慢性感染性疾病，最终可导致牙齿松动脱落。目前，牙周炎很难根治，且治疗易反复。荧光探针在牙周炎致病菌也有较广泛的应用。
Choi 等使用地高辛标记荧光的寡核苷酸探针，在石蜡包埋组织中定位牙周炎患者的细菌。该探针易于制备且稳定，细菌信号被检测为球菌、杆状、梭形和毛状等离散形式。于娜等构建了一种荧光探针TR4，可结合菌斑生物膜且支持体外检测，通过观测荧光的变化得到细菌的变化情况。
Jiang 等用透膜荧光探针Fe- TRACER，鉴定了 17 种牙龈卟啉单胞菌铁相关蛋白，提供了荧光探针结合转铁蛋白的 X 射线结构，为理解病原体中的铁稳态提供了基础。Sawhney 等从45 名参与者所有牙龈中收集涂片并用吖啶橙染色剂染色，应用荧光探针进行评估，观测从正常牙周到受损牙龈上皮的演变，并能量化受损牙龈上皮的损伤程度，有助于临床医生确定预后。
2.1.4 其他口腔疾病细菌
除上述疾病的主要致病菌外，口腔生物膜中还含有大量的其它细菌，是口臭、口腔扁平苔藓(oral lichen planus， OLP)等疾病的感染来源。
Bernardi 等使用寡核苷酸荧光探针进行染色，从而实现对舌背生物膜内的细菌可视化和量化，有助于研究口臭的致病因素。Gorpas 等将荧光光谱设置在360～560 nm， 通过时间分辨荧光光谱法检测病变OLP与周围正常黏膜荧光的变化，开发了新型OLP诊断技术。Ramesh等使用自体荧光光谱来区分20 名OLP患者和16 名正常志愿者的口腔组织，发现最佳激发波长为320 nm， 利于评估口腔黏膜变化情况。 Yao等从口腔念珠菌病患者中收集了106 份口腔拭子和122 份口腔活检组织，将真菌培养和高碘酸- 希夫染色与钙氟白荧光染料染色对比，证实后者可作为念珠菌病早期诊断的有效工具。
2.2 应用于非生物结构表面
细菌生物膜会附着所有组织的表面，口腔生物膜就不可避免地影响口腔内非生物结构，如义齿修复材料、口腔种植材料、口腔正畸材料等，引起种植体周围炎和义齿性口炎等疾病。
2.2.1 义齿修复材料
口腔生物膜中附着在义齿修复材料表面的细菌会引起各种口腔疾病，定量研究细菌并去除附着在材料上的生物膜，显得极为有意义。
Garbacz等将荧光报告物碘化丙啶染色并与单核细胞共培养，通过荧光观察单核细胞对分离菌株的吞噬活性，结果发现单核细胞对义齿表面生物膜细菌的吞噬作用效率较低，不容易根除所定植的菌株。
Tsutsumi- arai等通过405 nm蓝光LED照射荧光显微镜显示，义齿基托树脂上几乎所有的念珠菌都能被辐射杀死，进一步研究发现，该波长的蓝光可有效地去除白色念珠菌和变异链球菌双种生物膜，并可能与细胞内卟啉发生反应。 Srimaneepong 等用荧光探针检测低分子量壳聚糖溶液去除义齿修复材料上白色念珠菌生物膜的效果。 Guimarães等用钙氟白荧光显微镜观察酵母的存在及其结构，且发现和评估了蒲公英挥发油的抗真菌活性。
2.2.2 口腔种植材料
口腔种植材料的周围组织可感染细菌，诱发种植体周围炎症。Zhou等使用4′， 6- 二脒基- 2- 苯基吲哚荧光染色等检测细胞附着和细胞活力，以确定种植体改性钛表面生物相容性是否良好。Peruzzi 等通过X射线荧光分析，检测多种体外模式下镁-钆螺钉植入部位有无钆积累，证实了在降解过程中钆合金的去除非常有限或没有发生。
2.2.3 口腔正畸材料
Garcez等使用405 nm的激发波长和蓝带滤光片，通过量化自体荧光图像，对40个正畸用微型螺钉进行评估，分析保留在微型螺钉周围生物膜中微生物的情况，并可以对牙龈卟啉单胞菌进行量化。Marya 等介绍了荧光探针应用于正畸治疗期间的牙齿脱矿检测和菌斑生物膜检测，更好地指导患者主动控制菌斑生物膜并积极接受治疗。
2.2.4 其他口腔材料
Bim等将罗丹明B(rhodamine B， RB)添加到粘性牙科粘接剂树脂中，确定了粘接剂树脂中RB浓度的最低范围0.1～0.02 mg/mL，能获得可接受的牙本质粘接剂界面图像，发现了荧光探针在树脂基材料中的最佳用途，提高了树脂性能，为后期制备含有低浓度RB的粘性树脂样品提供了依据。
3. 总结与展望
荧光探针具有灵敏度高、光谱可调节、成本低、应用前景广阔等特点，已成为口腔生物膜研究的重要工具。但是，截止目前为止，大部分口腔疾病的口腔生物膜还无法用荧光方法检测，而且荧光探针在疾病治疗和监测方面应用较少。因此，开发设计能吸收和发射长波长的、具有新识别基团和亲和力的新型荧光探针，使其与生物分子更有效结合，提高其空间分辨率及成像深度，才能扩大其应用范围、成为口腔疾病诊治的利器。
