正畸患者牙龈卟啉单胞菌基因检测

　　【摘要】　目的　对正畸患者口腔中牙龈卟啉单胞菌等牙周致病菌进行检测。方法　选择16例固定正畸患者发生牙周炎症的牙周袋和牙周健康的龈袋为取菌斑样本点，分成牙周炎症组和对照组。根据改良聚合酶链反应检测技术，直接检测临床标本中牙龈卟啉单胞菌的Fim A基因，并做此检测技术的敏感性和特异性实验。结果　牙周炎组牙龈卟啉单胞菌的检测阳性率(56.3%)显著大于对照组(18.8%)，P＜0.05。检测技术的敏感性和特异性较高。结论　改良聚合酶链反应检测技术是一种敏感的基因检测方法，可应用于正畸患者牙周致病菌的监测。
　　【关键词】　正畸矫治　　牙周健康　　牙龈卟啉单胞菌　　Fim A基因

　　一般来说，正畸过程中的牙龈炎症是属于可恢复性的，但是如果在牙周致病菌的介入下，则会引起牙周附着丧失和垂直骨丧失，这种破坏是非可逆性的［1］。因此，临床上有必要监测牙周致病菌的状况，防止不可逆性的牙周损害。现已证实牙龈卟啉单胞菌等是牙周主要致病菌，本研究对基因检测技术应用于正畸患者牙周致病菌的监测做初步探讨。

材料和方法

　　样本收集：选择16例正畸患者，年龄11～13岁。安氏I类或II类错，牙齿拥挤I度，设计为不拔牙矫治，全口戴用方丝弓矫治器。治疗前口腔卫生状况良好，菌斑指数为0～1，牙龈指数为0～1，龈沟出血指数为1，无全身系统疾病。正畸前做牙周宣教，矫治6～7个月后进行牙周检查，每人各选择一处取牙周菌斑样本点，组成牙周炎症样本组。其条件为：牙龈红肿，菌斑指数为2～3，牙龈指数为2，龈沟出血指数为3。同一个人另选择一处龈袋为取菌斑样本点，组成自身对照组。其条件为：牙龈外观健康，菌斑指数为0，牙龈指数为0，龈沟出血指数为1。两组样本各有16例，取标本时先去牙石，局部清洁，将小环插入袋底部贴根面取出［2］。
　　细菌DNA的提取：将临床样本混悬于装有0.1ml生理盐水的Eppendorff管中，在旋涡混合器上震荡混匀。弃上清，加入25μl细胞裂解液和蛋白酶K，用震荡器使其混匀。热水浴后冰上放置，旋转，取上清转移到新管中待用。
　　引物合成：根据牙龈卟啉单胞菌Fim基因，设计寡核苷酸引物序列，由北医大人民医院中心实验室合成引物1、2。其序列为P1-5′ ATAATGGAGAACAGCAGGAA3′ 和P2-5′TCTTGCCAACCAGTTCCATTGC3′，扩增片段为131bp。
　　基因扩增反应：依次加入缓冲液5μl dNTP2μl,TaqDNA聚合酶1μl，引物1和引物2各1μl，细菌的DNA 1μl，三蒸水14μl，总反应体积25μl，混匀后加10μl石蜡油。以牙龈卟啉单胞菌标准菌株ATCC33277为阳性对照。反应按预变性94℃4分钟，变性94℃45分钟，退火56℃45分钟，延伸72℃60分钟，30个循环，后延伸72℃5分钟。
　　扩增基因的检测：取扩增产物10μl，2%琼脂糖凝胶电泳，以PBR322DNA/BSTNT为分子量大小参照物，紫外灯下观察。与阳性对照产生相同的一条特异性131bp扩增带的为阳性标本，其它不出现此扩增带的则为阴性标本。
　　检测技术的敏感性实验：纯化的牙龈卟啉单胞菌DNA经紫外分光光度计定量，从100ng/μl开始，10倍系列稀释至100fg/μl，按本技术分别进行基因扩增反应，2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察。
　　检测技术的特异性实验：提出了16株不同类型细胞的标准菌株DNA，20株临床分离的牙龈卟啉单胞菌株DNA，取50ng-100ng DNA进行PCR扩增。

结　　果

　　临床标本的检测：结果见附表。牙周炎症组牙龈卟啉单胞菌的检测为56.3%，对照组为18.8%。经卡方检验，两者有显著性差别(P＜0.05)。

附表　正畸患者牙龈卟啉单胞菌基因检测结果

　检测技术敏感性较好：稀释到1pg/μl DNA仍可检测到131bp扩增带(附图)。1pg牙龈卟啉单胞菌DNA，约相当于68个细菌。