基于miRNA治疗牙周炎和种植体周围炎的研究进展

    微小RNA（microRNA，miRNA）是一类由大约22个核苷酸组成的小分子非编码RNA序列，与Argonaute蛋白家族（argonaute family protein，AGO）结合可形成miRNA诱导的沉默复合体（miRNA-induced silencing complexes，miRISCs）的核心，沉默或者诱导目标mRNA降解，影响目标基因编码蛋白的合成。
    自1993年miRNA被发现以来，大量研究表明miRNA参与细胞几乎所有的生命活动，包括细胞增殖、分化、代谢、免疫以及细胞死亡；在机体层面miRNA与多种疾病过程密切相关，如炎症反应、肿瘤发生等。同时，miRNA在物种间保持高度的保守性，既表明miRNA在生物进化过程中始终保持着调节关键生命途径的重要功能，又有利于构建动物模型进行miRNA的相关研究。这些研究以及理论成果极大的促进了基于miRNA的治疗措施发展。本文将对牙周炎和种植体周围炎中miRNA表达和基于miRNA的治疗措施进行阐述。
    1.口腔炎症中的miRNA
    相关研究表明，在炎症反应中miRNA的表达量会发生不同程度的上调或者下降。炎症过程主要由各种炎症细胞以及细胞因子介导，此过程中炎症的起始发生、峰值程度以及消退均有miRNA参与进行控制。口腔环境中的炎症包括牙周炎和种植体周围炎等，牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonasgingivalis，P.g）是牙周炎的主要致病菌，随着炎症发展会导致牙槽骨吸收，附着丧失，严重时造成牙齿松动、脱落，影响口腔功能。
    由于miRNA在不同疾病中表达水平的变化，利用miRNA进行口腔鳞状细胞癌的诊断和预后评估已有相关研究报道，口腔炎症性疾病中利用miRNA进行疾病筛查也同样成为可能。Micó-Martínez等发现慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）患者龈沟液（gingival crevicular fluid，GCF）中仅有miR-1226显著下调并与对照组有显著差异。
    而Nisha等研究发现miR-143-3p是牙周炎患者唾液中表达上调变化最大的miRNA，倍数变化达5.82倍；Tomofuji等则通过构建Wistar大鼠牙周炎模型发现血清中上调的miR-207、miR-495可能是牙周炎血清中的重要生物标志。而在种植体周围炎中，相关的研究并不多见。
    种植体周围炎是以菌斑生物膜为始动因子，在多因素共同影响下发生的感染性疾病，致病菌与牙周炎致病菌类似，包括牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌（Prevotella intermedia，P.i）等，可使种植体周围骨组织吸收，骨结合丧失，从而导致种植治疗的失败。根据Carcuac等的研究，种植体周围炎由于组织结构的特殊性，其病变面积是牙周炎的两倍，病变周围缺少非浸润区，同时主要以CD138+浆细胞、CD68+巨噬细胞以及髓过氧化物酶阳性（myeloperoxidase-positive，MPO+）多形核白细胞浸润为主。
    Wu等构建犬种植体周围炎模型，使用TRIzol从病变牙龈组织中提取RNA，qRT-PCR结果显示let-7g、miR-27a表达显著下调，而miR-145表达量显著上调，提示这3种miRNA可能在种植体周围炎中起重要作用。由于miRNA在众多疾病中作用的普遍性，其在牙周炎及种植体周围炎中的表达特异性以及能否作为非侵入性标志物仍值得商榷，且如何从众多表达发生变化的miRNA中选择稳定、准确的标志物仍需要大量研究。
    2.基于miRNA针对炎症的治疗措施
    目前基于miRNA的治疗措施主要分为两类，包括miRNA模拟剂（miRNA mimics）和miRNA抑制剂（miRNA inhibitors）。miRNA模拟剂是人工合成的双链小RNA分子，在引入细胞后的行为与内源性的miRNA相似，通常通过甲基化增强稳定性或者与胆固醇等分子相连以促进细胞摄取。不同载体的引入使得miRNA模拟剂药物的设计十分多样，例如由于不同血清型的腺相关病毒（adenovirus-associated virus，AAV）对人体不同组织的亲和力不同，利用AAV载体传递miRNA能起到靶向药物的效果。
    miRNA抑制剂又称为抗miRs（antimiRs），是目前使用最广泛的体内调节miRNA水平的方式。抗miRs是单链的反义寡核苷酸（antisenseoligonucleotide，ASO），通过与内源性miRNA全部或部分互补的反向序列降低内源性miRNA的水平。在设计时可通过添加硫代磷酸酯样集团或者甲基化、锁核酸修饰（locked nucleic acid，LNA）增加其稳定性，或者是通过载体封装保护RNA分子以避免细胞内部降解问题。
    目前基于miRNA的治疗措施应用最广泛的领域是肿瘤、中枢神经系统疾病以及心血管疾病等，其中多种疾病在发生发展中均存在炎性微环境，而大多数基于miRNA的药物都具有一定的抗炎作用。例如miR-155靶向下调一种参与免疫应答调节的多磷酸肌醇-5-磷酸酶（inositolpolyphosphate-5-phosphatase，SH2 domain-containing inositol5-phosphatase 1，SHIP1），促进肿瘤微环境中的炎症发展，导致正常成纤维细胞表型转化为肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）而具有促肿瘤作用。
    基于此理论，Cheng等利用低pH诱导的跨膜结构肽搭载antimiR-155（pHLIP-antimiR155），可有效减缓小鼠淋巴瘤的生长和转移。此外，Worm等研究还表明，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激小鼠导致急性炎症也会使体内miR-155上调，而通过全身性使用LNA-antimiR-155可导致CCAAT/增强子结合蛋白β（CCAAT/enhancer binding proteins，C/EBPβ）表达水平下降和小鼠脾细胞中粒细胞集落刺激因子G-CSF表达下调，突显了miR-155拮抗剂在慢性炎症治疗中的潜力。除了miRNA模拟剂和抑制剂，用特定药物靶向调节炎症中功能性miRNA的水平是另一种思路。
    Qu等研究发现，肉桂醛（cinnamal dehyde，CA）可以抑制RAW264.7巨噬细胞中LPS诱导的miR-155、miR-21的表达，从而降低IL-1β和IL-6的水平以减轻炎症，CA可能是一种潜在有效的治疗溃疡性结肠炎的药物。
    3.牙周炎和种植体周围炎的miRNA治疗
    3.1牙周炎的治疗
    牙周炎可由牙周软组织炎症发展至牙周硬组织的破坏，即牙周骨的吸收破坏。目前基于miRNA治疗牙周炎的相关研究主要集中在调节牙周破骨细胞的分化和减少牙周骨丢失上。
Hong等和Akkouch等研究均发现使用聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）纳米颗粒转染或转导的miR-200c可有效抑制人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament fibroblasts，HPDLF）中白介素6（interleukin-6，IL-6），IL-8和趋化因子配体5（CC chemokine ligand 5，CCL-5）的表达，并增加人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs）中包括钙、ALP和Runx2等成骨分化标志物的分泌，表明miR-200c可能可以通过抑制炎症和破骨细胞生成、增强骨骼再生而预防牙周炎相关骨质流失。
    Ge等通过在人牙周膜干细胞（humanperiodontal ligament-derived stem cells，hPDLSCs）转染miR-543研究发现miR-543通过抑制其靶基因TOB2发挥作用，促进hPDLSCs成骨。另有研究表明miR-146也有同样的作用。除了miRNA模拟剂，miRNA抑制剂也同样应用于牙周炎成骨方向治疗的研究。
    Bao等发现LPS刺激的PDLSC中miR-148a表达上调，神经纤毛蛋白-1（neuropilin-1，NRP-1）水平下降，使PDLSC成骨功能抑制，而抑制miR-148a可恢复慢性炎症环境中PDLSC的成骨分化。在IL-1β诱导的炎症微环境中miR-325-3p的升高同样会抑制成骨细胞的分化，而Wang等则发现miR-325-3p抑制剂可有效减少牙周炎相关的骨丢失。此外，直接靶向关键miRNA治疗牙周炎的思路也同样可行。
    Miller等发现miR-182通过靶向转录因子Maml1和Foxo3促进TNF-α诱导的破骨细胞生成，因此转录因子RBP-J通过下调miR-182表达可以抑制破骨细胞的形成。针对牙周炎的miRNA疗法还可以通过调节炎症发生过程中的信号通路以及炎症环境中的细胞凋亡进行。在牙周炎中miR-200b、miR-21上调，而miR-212-5p及miR-210表达下调。
    Matsui等研究发现在牙龈炎症组织中炎性细胞因子诱导miR-200b上调，既可以靶向抑制IκB激酶β（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase β，IKKβ）阻断促炎性NF-κB信号通路的经典激活途径，又可以抑制E盒结合锌指蛋白同源盒1（Zinc-finger E-box-binding homeobox 1，ZEB1）表达。ZEB1能够下调E-钙粘蛋白（E-cadherin），而E-钙粘蛋白负调控NF-κB信号通路的转录活性，miR-200b可通过IKKβ和ZEB1两条路径抑制NF-κB信号通路活性，降低IL-6的表达，其模拟剂能够增强该效应。
    而在P.gLPS刺激的巨噬细胞中，miR-21表达也出现上调，其模拟剂也可通过程序性细胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）抑制巨噬细胞促炎细胞因子的产生，减轻局部炎症。这与Qu等的研究结果相反，可能是由于在不同组织中miR-21与NF-κB间复杂的相互作用，miR-21一方面可以通过抑制同源性磷酸酶-张力蛋白（phosphatase and tensin homolog，PTEN）激活NF-κB，另一方面又可以通过PDCD4或E3泛素连接酶1（pellino E3 ubiquitin protein ligase 1，PELI1）下调NF-κB。
    另有研究表明，在P.gLPS刺激诱导的牙周炎组织中miR-212-5p及miR-210表达下调，但其模拟物也可分别靶向髓样分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）和低氧诱导因子3α（hypoxia-inducible factor 3α，HIF-3α），抑制NF-κB和p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）信号通路的激活，从而减轻牙周的炎症。
    Tang等提出miR-146a通过TRAF6/p38途径负调控HPDLF对P.g的炎症反应，而Jiang等则发现miR-146a通过靶向IRAK1而非TRAF6调节P.gLPS刺激的B细胞中炎性细胞因子产生，靶向路径的不同可能是由于细胞系的不同，但是均下调了IL-1β和IL-6的表达，其抗炎作用确切。在靶向调节目标miRNA方面，Zheng等发现miR-22-3p可以通过沉默PDLSC中的沉默调节蛋白1（sirtuin1，SIRT1）来调节PDLSC的增殖和分化，而烟酰胺能诱导PDLSC中miR-22-3p表达，提示miR-22-3p在牙周治疗中的应用前景。
    尤其值得一提的是，非编码长链RNA牛磺酸上调基因1（taurine-up regulated gene 1，TUG1）在LPS刺激的hPDLCs中表达下调，但是其过表达既可以靶向下调miR-132以减轻增殖抑制和细胞凋亡，同时也可以负调控另一靶标miR-498，通过miR-498/RORA介导的Wnt/β-catenin信号转导来预防牙周炎，提示利用TUG1靶向调节miRNA治疗牙周炎的潜力。
3.2种植体周围炎的治疗
    基于miRNA治疗种植体周围炎的相关研究较少。Wu等在犬种植体周围炎模型上构建了增强miR-27a表达的递送系统，并确定了Dickkopf2（DKK2）和分泌型卷曲相关蛋白（secreted frizzled-related proteins，SFRP1）是miR-27a的直接靶标，实验发现经过miR-27a递送处理的实验组能够优化体内新骨形成和整合的过程。
    DKK2和SFRP1均是Wnt信号通路的抑制剂，miR-21a对其表达的抑制激活了Wnt信号通路的成骨和血管能力。Wang等研究表明miR-128的上调也同样可通过靶向DKK2，促进碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的表达以促进大鼠骨髓干细胞（ratbone marrow stem cells，rBMSCs）的成骨分化。此外，NF-κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）同时也是一种破骨细胞分化因子，其过表达可以促进骨吸收。
    Pan等利用抗RANKL抗体（anti-RANKLantibody）显著抑制了小鼠牙周炎模型中RANKL的表达，同时还发现具有抗炎作用的miR-146a通过调节TLR2/4信号传导和抑制TNF-α的表达进一步加强了该作用。miRNA在种植体周围炎中调节并促进新骨生成具有极大的潜力，是维持种植体稳定性和咀嚼功能的可行方法，能够提升口腔种植牙手术的成功率。
    4.结语与展望
    随着更多分子机制的揭示，越来越多的miRNA调节通路被实验证实，但是目前的miRNA疗法仍面临较多的困难和挑战，例如靶标miRNA及递送方式的选择以及如何避免细胞内降解问题。尽管如此，现有研究仍显示出miRNA治疗药物在牙周炎和种植体周围炎治疗中甚至是在骨再生组织工程中的应用前景，miRNA在机体中复杂的分子作用网络值得进一步的深入研究。基于miRNA的治疗方式有望与传统的口腔治疗相结合，联合应用于预防和治疗牙周炎和种植体周围炎。