难治性根尖周炎根管内及根尖外菌群的研究现状

    难治性根尖周炎（refractory apical periodontitis，RAP） 是指通过规范的根管治疗后，仍不能彻底清除根管内或根尖外感染，并有临床症状和/或影像学表现的慢性根尖周炎，又称持续性根尖周炎（persistent apical periodontitis，PAP）。RAP的难治性偏重治疗难度，而PAP的持续性偏重病理改变。RAP根管内外的细菌较原发感染根管有所不同。
    许多学者运用不同取样方式及检测技术研究了RAP感染的细菌特异性，所获得的菌群种类存在局限性和差异性。随着取样方法及分子检测技术的不断更新，本文总结了近十年相关研究，对采用不同技术手段获得的RAP根管内与根尖外菌群检测结果的共性与差异作一综述。
    1.根管内优势菌的检出
    1.1 样本获取
    从根管取样是为了获得根管系统中的细菌样本，但不同的取样方法均难以完全复原根管中的细菌种类，故选择合适的取样方法一直是细菌检测的重要问题。一直以来被广泛使用的方法是去除根管充填物后用无菌纸尖从根管内取样，但研究者大多认为其在取样的范围和深度上存在局限性。
    不同于在主根管中较易被蘸取的浮游细菌，许多细菌定植于牙本质小管深处、根管峡部等，或形成生物膜，很难通过纸尖获得；去除根管填充物后，黏附在牙胶上的细菌同时被去除，因此细菌丰度可能被低估；根管样本也不能提供感染根管不同部位的细菌种类与数量差异的信息。从根管内取样的文献大多以纸尖取样为主，并得到了相似的优势菌群。但也有研究者采用不同的取样方式。
    Bouillaguet等用K锉从拔牙后切下的5 mm根尖的根管内取样，结果与根管内纸尖取样基本相同；Karygianni等将充填材料的取样与纸尖取样相结合，在充填材料中还检测出小韦荣球菌、副血链球菌、黏滑罗斯菌3个类群。单一纸尖取样有一定的局限性，结合充填材料取样可更有效、更加全面获得根管内的定植细菌。
    1.2 检测方法
    细菌检测方法主要分为细菌培养法与非培养方法。这两种方法的结果有时并不相同，但可相互补充。随着现代分子技术的快速发展，单独采用细菌培养法的研究越来越少，但也不能忽视其价值。
    1.2.1 细菌培养法
    细菌培养法是传统的细菌鉴定与研究的基础实验方法，但有许多局限性，如仅有40%~50%的口腔细菌可以培养。Medina-Palacios等单独采用厌氧细菌培养鉴定15例RAP样本得到26种细菌，88.5%属于兼性厌氧，11.5%属于专性厌氧。
    1.2.2 非培养方法
    不断更新的分子技术因其高灵敏度、特异性和高通量等特点，能够鉴定可培养和不可培养的细菌。分子生物技术大多数为定性检测，也存在一些缺点，如聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）和克隆分析会由于能从死细胞中检测DNA、差异DNA提取或优先DNA扩增而导致一些偏倚，这可能会高估某些物种的作用，同时低丰度菌株的DNA可能丢失。
    目前，常用于鉴定根管感染的分子技术包括PCR、DNA-DNA杂交、焦磷酸测序等。PCR可用于从多个DNA分子的混合物中复制某个细菌特异性的DNA链。应用PCR技术，张富华等在20例患者中共发现15种细菌，其中粪肠球菌出现频次最高，微小单胞菌次之。
    孙慧斌等在40例样本中发现检出率最高的也是粪肠球菌，还有中间普雷沃菌、牙龈卟啉单胞菌等。巢式PCR也曾被Barbosa-Ribeiro等采用。16S rRNA基因有一个精确比对的保守区域，有助于对感染根管进行更详细的细菌筛选。运用16S rRNA基因测序，Cardoso等检测到了牙髓卟啉单胞菌、连翘银斑菌、牙龈卟啉单胞菌、齿密螺旋体。
    高通量焦磷酸测序是一种基于“合成测序”原理的DNA测序方法，它一次处理的数据量与采样深度前所未有，可以检测到丰度很低的细菌，并有效地区分细菌种类。王娟等采用PCR与焦磷酸测序法检测得到了厚壁菌门、螺旋体门等。此外，荧光原位杂交、下一代测序技术、聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳（polymerasechain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE） 等分子技术也在近年的微生物研究中被广泛应用。
Sánchez-Sanhueza等用下一代测序技术检测到RAP中细菌最丰富的家族是假单胞菌科，细菌数量最多的是变形菌门；何洪旭等用PCR-DGGE检测得到粪肠球菌、普氏消化链球菌等。
    1.2.3 细菌培养方法和非培养方法对比
    研究表示：两种方法检测的细菌类群相似，但非培养技术发现的细菌多样性更高，也更易发现一些之前并未获得过的细菌。Anderson等将两种方法相结合检测21例样本，发现的26个类群主要属于厚壁菌门、放线菌门、变形菌门和拟杆菌门，两法检测到的微生物区系多样性非常相似，其中培养法在充填根管内检测到细长奈瑟菌、口腔放线菌、细棒状杆菌、变形杆菌和鲁梅尔芽胞杆菌5个菌属，PCR也发现了鸡肠球菌、加氏乳杆菌、欧陆森氏菌等8种细菌。
    Endo等也同时采用两种方法检测同一样本共15例，得到的结果并不一致，通过培养发现最常见的细菌为葡萄球菌、放线菌、孪生球菌、嗜血杆菌和肠球菌；而PCR检出最多的菌种为微小单胞菌、变黑普雷沃氏菌、粪肠球菌和麻疹芽胞菌。通过更新的分子技术发现了之前的培养法中少见的专性厌氧致病菌如卟啉单胞菌属、消化链球菌属、普雷沃氏菌属等，这对将来更好地研究其致病机制及临床症状起了一定作用。
    培养法不能培养所有细菌，而分子技术虽可鉴定不能被培养的细菌，获得更高的细菌多样性，但也有许多缺陷。无论是用哪种技术培养或检测都可能有未被检测到的物种，且检测到的物种也仍未发现其确切的临床相关性。两者结合使用可以相互补充，获得更完善的结果，发现更多种类与数量的细菌。
    1.3 优势菌
    RAP中感染菌群复杂，最主要的细菌是革兰氏阳性（Gram-positive，G+）菌，以兼性厌氧G+球菌和棒状菌为主，有学者报道G+菌对化学-机械处理更有抵抗力，可长期处于低代谢活性的静止期。还有不同的革兰氏阴性（Gram-negative，G-）厌氧菌，也在RAP中起重要作用。
    在对RAP根管内样本的研究中发现检出率高的细菌种类大致相同，最常被检出且丰度最高的有厚壁菌门、放线菌门、变形菌门、拟杆菌门、梭杆菌门。群落的多样性表明，细菌可能形成群落组合导致根尖周组织的持续炎症，而不是由特定的细菌种类导致。厚壁菌门属于G+菌，包括常见的葡萄球菌属、肠球菌属、链球菌属、梭杆菌属、消化链球菌属等。尤其是肠球菌属的兼性厌氧粪肠球菌，数十年前就在根管治疗失败后的感染根管内频繁检出。
    粪肠球菌不是口腔共生菌群的一部分，但能够在牙本质小管中定居，形成生物膜，忍受长时间的营养缺乏，对多种根管内药物和抗生素具有耐药性，因此能在根管治疗后存活，极难清除。继发性/持续性感染的牙齿含有粪肠杆菌的可能性比原发感染的牙齿高9倍。
    多年来，粪肠球菌一直被认为是RAP的主要病原体，然而一些报告提出了不同意见，Dioguardi等认为：在原发性与继发性根尖周炎中，粪肠球菌含量无显著差异。Chow等认为：粪肠杆菌没有高毒性，不是维持根尖周炎损害的强病原体，只是因为它们生存能力强易在RAP中检出。
    Zhang等的研究表明：不论是否伴有根尖周病变，粪肠杆菌在根管治疗后的牙齿中都同样存在。放线菌门是口腔正常共生菌群，为厌氧G+杆菌，在原发性和继发性感染中都存在，几乎在所有RAP根管内都被检测到。变形菌门包括常见的奈氏球菌目、伯克氏菌属、肠杆菌科和假单胞菌科等。
    梭杆菌门是一小类严格的专性厌氧G-菌，常见于消化道，是口腔正常菌群，也可导致根尖周病；其中，包括核梭杆菌、具核酸杆菌等。拟杆菌门是专性厌氧G-杆菌，包括根尖周炎常见的卟啉单胞菌属，在Cardoso等的研究中，牙髓卟啉单胞菌是根管中检出最多的菌种，其次是牙龈卟啉单胞菌等。
    Sánchez-Sanhueza等发现：细菌最丰富的家族是假单胞菌科，细菌数量最多的是变形菌门，其次是拟杆菌门；变形菌门在有症状患者中比无症状患者中丰度更高，而拟杆菌门在无症状患者中丰度更高。原发性根尖周炎中G+菌和G-菌各半，严格的厌氧细菌占主导，有5~12个属。
    而RAP存在的主要原因是根管治疗后根管内或根尖外残留菌群的持续感染，或其他各种原因导致的继发感染，兼性厌氧G+菌占主导地位，故RAP中的部分菌群尤其是G+菌多是继承原发性根尖周炎而来，种类减少而丰度降低，剩余的是抗药性强且难以去除的细菌，尤其是肠球菌属、链球菌属、放线菌属、消化链球菌属、丙酸杆菌等占主导。同时，可能由于冠部封闭不严密，有利于兼性厌氧细菌的生长而形成新的根管感染。
    2.根尖外优势菌的检出
    根尖外感染存在多种菌群，甚至形成根尖外生物膜，而根管治疗无法控制根尖外生物膜，这可能是RAP根尖外感染持续的重要原因之一。
    2.1 样本获取
    获取根尖外感染样本的方法绝大多数以术中无菌垂直截取根尖3 mm为主。Ping等将根尖样品低温研磨并从中提取DNA，以期完整地采集根尖周炎牙根管内和根管外的菌群。Signoretti等用刮匙刮除部分根周组织后发现：根尖病变中，G+菌存活率最高。Pereira等则结合截根和刮取组织两种方法，结果发现：在根端和根尖周标本中以具核梭杆菌、害肺杆菌和福赛斯坦纳菌最为常见。就目前研究来看，同时采集根尖及根尖周样本可能使研究结果更为完善。
    2.2 检测方法
    根尖微生物的检测手段亦分为细菌培养法与非培养方法。近十年来，对根尖外感染的研究采用多种手段联合检测。因为根管外生物膜的存在，研究者们还常用Brown & Brenn染色观察生物膜的组织形态与组成。Signoretti等仅用细菌培养法观察发现：根尖病变中G+菌存活率最高；秦彦涛等结合此法、细菌培养和16S rDNA 克隆技术检测到放线菌属、丙酸菌属；Wang等结合此法与PCR在23例根尖标本中检出的菌属与秦彦涛等发现的相同。
    Zhang等将RAP根尖样本分为根外生物膜组与根尖周病变组，用16S rRNA基因克隆测序，结果发现：细菌数量最多的是厚壁菌门。在根外生物膜组中单独发现了链球菌等10种菌。在根尖周病变中单独检出了变形杆菌、柠檬酸杆菌和微小单胞菌。
    周焱等通过16S rDNA克隆文库法检测出的细菌大部分集中在厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和未培养菌，其中具核梭杆菌检出率最高。周耀等用PCR-DGGE检测技术得到了放线菌属与丙酸菌属。Ping等还采用了焦磷酸测序法。
    2.3 优势菌
    根外感染细菌通常以附着在根表面的生物膜形式存在，也可以以菌落和/或浮游细菌细胞的形式存在。Signoretti等发现：RAP患牙的根尖周微生物种类繁多，主要是G+菌，还有G-专性厌氧菌或兼性厌氧菌。G+菌细胞壁强健的结构成分使其在极端条件下表现出快速适应性，从而成为根管治疗后疾病的潜在致病因素。
    优势菌属包括放线菌属、丙酸菌属、梭杆菌属、假单胞菌属、卟啉单胞菌属、普雷沃菌属和链球菌属。尤其是放线菌属、丙酸菌属有菌毛结构擅于聚集黏附，能够清除营养物质并抵御宿主免疫机制，难以通过治疗去除根外残余。除了内毒素、蛋白酶等常规因素诱导与维持炎症反应、诱导免疫反应等，部分根外优势菌形成的生物膜也是致病因子之一。值得注意的是，研究一般将有窦道的根尖周炎患者排除在外，因为窦道构成了根尖周病变与口腔之间的通道，改变了根尖周环境和局部微生物分布。
    3.RAP 根管内及根尖外感染菌群的来源
    规范的根管治疗能促进根管内细菌的清除，改变了菌群的组成，在治疗后营养缺乏的根管环境中，只有部分细菌能够存活，它们或对根管药物产生耐药性，或治疗无法触及，或形成生物膜以适应恶劣环境。RAP根管内细菌区系与原发性根管内感染基本不同，且其中细菌的多样性与含量均更少。
    RAP感染可能是多种因素引起的，虽然某些细菌的存在似乎很明确，但感染的真正来源仍未确定。目前认为根尖部封闭不严、冠方封闭体的缺失和根尖部微生物残留是引起RAP 的主要原因。其实很难区分导致继发感染的细菌是原发感染遗留下来的细菌，还是新引入的细菌。由于根管系统的解剖结构限制，难以获取有代表性的样本。
    这在症状缓解期的患者中更为明显，因为在根管中可接触到的细菌数量很低，在去除根管充填物的过程中，许多细菌可能会丢失。结果样本数量会减少，可能会低估某些特定菌种的流行。同时，并不是所有残存细菌都会导致疾病持续存在，约68%根管内有残存细菌的患牙根管充填封闭后仍能愈合。
    残留的细菌也必须存在于根尖孔附近才能持续诱导根尖周炎。入侵根尖周组织的细菌通常被免疫反应清除，然而一些物种如放线菌能依靠黏附机制逃避宿主免疫细胞的吞噬。相比之下，根尖外优势菌群中G+菌，尤其是放线菌属、丙酸菌属，与G-的普雷沃氏菌属等的检出率格外高。而根管内优势菌群中球菌尤其是葡萄球菌属、链球菌属及单胞菌属等更为多见。
    粪肠球菌等则在根管内外差异并不明显。要判断根管内外菌群是否关联，笔者提出2种假设，引起根尖外感染的细菌的生存和代谢要么依赖于根内细菌，要么独立于根内细菌。在依赖的情况下，一旦通过根管治疗解决了根内感染，根外感染也自动解决；相反，当根尖外感染是独立的，即使根管治疗成功后根外感染仍然存在。
    一些研究发现：根内外生物膜相邻，且两者的特殊结构差异不明显。这些观察结果支持了根外生物膜通常是根内感染的延伸的假设。根尖孔与牙周膜的解剖学连接可使细菌入侵根外组织，当致病菌的能力达到一个阈值就可能诱发根尖周组织的炎症。
    在长期感染中，细菌可以在根面、或根管充填的无症状牙的根周病变中心存活，这些细菌具有隔离营养物的能力，可以克服宿主防御机制。另一种看法是，这些根尖外细菌结构是否独立于根内感染仍有待确定。鉴于这些细菌结构的高度组织性，有理由相信它们可能不会受到根管治疗的显著影响。因此，这些成熟的根外生物膜可能成为独立的感染源。但这种看法的研究支撑很少。
    此外，根外感染在有窦道的患牙中很常见，窦道长期存在可能成为根周和外部环境之间的通道，唾液中的矿物质和盐由此进入根尖周组织改变微环境，也改变局部细菌的分布。
    4.小结
    综上所述，不同研究中菌群之间的差异可能是由多种因素综合造成的，尤其是随着分子技术日新月异，所检测出的细菌种类与数量都有很大进展。虽然在RAP根管内外感染的众多研究中发现了相似的优势菌，但两者的联系、差异与致病作用都有待进一步的证实。
    尽管根管治疗的效果有较高的可预测性，但完全根除细菌仍不容易，不是所有的根尖周炎都能通过规范的根管治疗解决。鉴于目前微生物研究的局限性，希望增进对细菌种类及特定菌种确切致病特性的认识，寻找更理想的材料、器械与技术手段以提高根管治疗的成功率。