近年来，骨组织工程（Bone Tissue Engineering,BTE）研究的热点主要集中在支架性能的优化上。许多不同生物材料制成的支架在BTE领域得到了广泛的应用，特别是利用天然生物高分子材料如胶原蛋白、海藻酸盐、壳聚糖等构建的有机-无机复合支架。这类材料通常都具有良好的生物相容性、生物降解性、取材丰富、安全无毒等优势，在骨再生领域中显示出了巨大的潜力。
胶原蛋白（collagen,Col）是细胞外基质(extra-cellular matrix,ECM)中的主要结构蛋白，具有多种优异的生物学特性，包括出色的生物相容性、生物降解性、低免疫原性以及较高的抗拉强度便于制成膜、海绵、水凝胶等多种形态，因此，非常适合应用于组织工程和再生医学。在骨的生物矿化过程中，Col具有磷灰石晶体的成核位，可以引导矿物晶体生长并沿纤维长轴排列。
但纯Col支架由于力学性能差，成骨效应欠佳，不适合单独用于骨等硬组织的修复。因此，学者们常将Col作为矿化有机模板与无机生物材料相结合。无机生物材料的加入可显著提高复合支架的生物活性、密度、断裂韧性、拉伸模量和强度。更重要的是，可以在一定程度上与Col实现骨组织结构和功能的仿生。
本文就近年来国内外关于Col/无机物复合支架的制备方法、体内外生物活性的研究进展及在骨修复方面的应用作一综述，以期为新型Col支架的研发及其临床应用提供借鉴。
1. 胶原/无机物复合支架促进骨再生的分子机制
生物支架参与成骨的过程不仅只是为细胞提供一个简单的生长空间，还涉及对细胞黏附、增殖、分化等过程进行调控。为进一步开阔Col/无机物复合支架在骨再生领域的应用并提高其应用效率，学者们就其促进骨再生的分子机制进行了相关研究。Mazzoni等人以人骨髓间充质干细胞（Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells,hBM-SCs）及其衍生物增强型绿色荧光蛋白（EGFP)-hBMSCs为材料，研究了羟基磷灰石（Hydroxyapa‐tite,HA）/Col支架促进成骨的作用机制。
实验发现HA/Col有利于成骨蛋白的表达，如骨钙素（osteo‐calcin,OCN）和骨桥蛋白（osteopontin,OPN）。在与hBMSCs共培养中，支架诱导了参与骨化过程的特定基因(BMP2/3、SPP1、SMAD3和SP7)的上调，此外还增强了在骨骼发育过程中起着核心作用的MMP9和MMP10的表达。
Tomokazu等人的研究发现，β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP)/Col协同作用具有两种生物学效应：通过β-TCP促进成骨细胞增殖和通过富含RGD的基序促进细胞分化，从而促进早期骨形成。Hyväri等首次报道了生物活性玻璃（Bioactive glass,BGS）可能通过激活p38 MAPK下游靶热休克蛋白27(HSP27)的信号传导来促进hBMSCs的成骨分化。Khoobi等的研究显示：碳纳米管（Carbon nanotubes,CNTs）在复合支架中的存在加速了成骨细胞的骨形成，并引导间充质干细胞成骨分化。此外，还可以通过进一步吸收特定的蛋白质来诱导骨分化。
骨再生过程涉及对复杂的成骨微环境进行调控，除成骨相关的细胞外，还与血管生成及骨免疫调节息息相关。但目前，学术界关于Col/无机物复合支架促进骨再生的分子作用机制尚未完全阐明，特别是在其促进免疫调节和血管再生等领域的研究还很匮乏。因此，未来我们需要开展更多基于分子水平的研究，为拓展Col基复合支架的临床应用打下夯实的基础。
2. 胶原/生物陶瓷复合支架
2.1 胶原/羟基磷灰石复合支架
HA是一种常见的磷酸钙生物陶瓷，具有良好的生物相容性、骨传导性及与天然骨主要无机成分相似等优点。在其众多形式中，纳米羟基磷灰石（nano-hydroxyapatite,nHA）由于粒径小、比表面积高、结晶度与天然骨接近等优势，受到了学者们的特别关注。Lei对比了两种HA，nHA和天然骨陶瓷(natural bone ceramic,NBC)，与Col形成的复合支架间的差异。结果显示，nHA/Col支架的微观形态更均匀规则，其力学性能得到了显著提升。MC3T3-E1在支架上的黏附、增殖及成骨相关基因的表达均高于纯Col及NBC/Col支架。
除此之外，学者们就HA/Col不同配比对支架成骨效果的影响也进行了探索。Ou较全面地比较了不同比例的HA/Col支架体内外成骨的表现，及与干细胞共培养时的体内成骨效果。实验显示，HA/Col在7:3组合时，能明显增加支架表面及内部募集细胞的能力，并通过OSX和OCN的高表达诱导成骨细胞分化，促进新骨形成，因而具有更好的生物学性能。
但单纯将材料机械混合，虽可得到与骨组织成分相似的支架，却始终难以模拟天然骨的微结构和微环境。而仿生矿化技术能有效调控无机物成核、晶体生长、相变、取向演变、颗粒组装等过程，使支架的微结构和功能更接近天然骨。
Li通过将静电纺丝技术与仿生矿化技术结合，将含有Ca2+和PO43-的Col溶液制备成原位矿化胶原基支架(IMHCS)。与纯Col(CS）及直接混合nHA的Col支架（HAS）相比，IMHCS矿物质晶体的分布更均匀，微观形貌更光滑连续，抗拉强度也明显增强。在与BMSCs共培养时，IMHCS更快地将培养基转变为碱性微环境，其细胞数量、扩张面积、迁移率、ALP活性及Runx2、OPN、OCN的表达水平均显著高于CS及HAS支架。
材料学和合成技术的不断发展，有效改善了传统制备技术在调控支架宏观厚度和排列方面的局限性，提供了支架相对理想的生物仿生结构和功能。但目前，制备具有高度有序分级结构的仿生nHA/Col支架仍存在一些亟需解决的问题，如nHA分散性较差，与Col的结合界面仍不理想。
复合材料在一定程度上改善了支架的力学性能和成骨效应，但仍不能完全克服本身的缺点，如HA的降解速率难以与成骨速率达到动态平衡、支架的力学性能仍无法媲美天然骨。此外，目前的nHA/Col支架仍很难实现对药物、生长因子的有效负载及缓释。因此，未来仿生nHA/Col支架的制备及其应用范围的扩展仍是BTE领域最具挑战性的方向。
2.2 胶原/β-磷酸三钙复合支架
β-TCP是种常见的骨科材料，可通过释放高浓度的Ca2+和PO43-改善细胞的生长并促进骨再生。与HA相比，β-TCP的生物相容性及生物吸收性更好，其诱导成骨细胞增殖及成骨分化标志物的表达也高于HA。体内、外实验也证明了β-TCP/Col支架在机械性能、生物活性等方面较两者的单一材料得到了改善。
Wang等的实验发现，将β-TCP/Col支架与脂肪间充质干细胞联合应用可显著提高细胞ALP、OCN和OPN的表达水平，增加表面相对钙含量，具有较强的成骨潜能。Tebyanian将β-TCP/Col和纯Col支架分别植入兔颅骨全厚度缺损区。在8周时，β-TCP/Col组新骨形成桥接缺损，很难区分缺损的边界和周围的骨组织。而同阶段的纯Col组仅观察到骨形成开始。
支架的机械稳定性和降解动力学在平衡成骨的过程中具有重要的意义，理想的情况下，支架降解的速率应与新骨生长和重塑的速率接近。但目前β-TCP/Col支架在体内的吸收速度及降解过程中是否能维持足够的机械稳定性仍缺乏充足的临床验证。此外，理想的BTE支架，还需具备对细胞、细胞因子、药物等稳定的负载能力。因此，对于支架的结构及制作工艺也提出了更高的要求。
有学者报道，通过3D打印和添加成骨剂双嘧达莫不仅可以使β-TCP支架在结构上与天然骨更接近，还可以加速β-TCP降解55%～90%/年，使吸收的β-TCP被更好地血管化并由骨组织替代。相信随着3D打印技术的不断发展，未来联合3D打印的β-TCP/Col支架在结构和功能上会有更大的提升。
2.3 胶原/生物活性玻璃复合支架
BGS是一种非晶硅基生物活性纳米材料，在BTE领域的应用过程中，BGS被证实能够上调成骨相关标记物的表达并引导骨样磷灰石形成，具有良好的骨诱导和骨传导能力。近年来，BGS也常与Col复合使用以解决热处理过程中容易结晶、机械强度差和脆性高等问题。
Dhinasekaran将生物活性玻璃纤维制备成中空（BGH）和实心(BGS)两种，并与Col结合形成支架。研究发现，Col/BGH支架不仅具有良好的机械强度和亲水性，还显著提高了生物活性。在与成纤维细胞(3T3)共培养时，Col/BGH不仅增强了细胞的粘附和增殖，还可促进细胞定向生长，其排列类似于天然骨ECM中的各向异性排列的方式。当与成骨细胞(MG63)共培养时，Col/BGH上生长的细胞其ALP活性、钙沉积、RUNX2、Col-type-1 mRNA、OCN及骨粘连蛋白的表达水平明显高于其他两组，表现出了更好的成骨活性。在鸡胚绒毛尿囊膜模型中，Col/BGH具有更高的血管生成率。
Ryan通过冷冻干燥法制备了胶原-铜掺杂生物活性玻璃支架(CuBG-CS)，该支架的压缩模量较纯Col支架提高了1.9倍。不仅能促进骨形成(钙沉积增加3.6倍)，还对金黄色葡萄球菌具有较高的抗菌活性(高达66%的抑制作用)。当在鸡胚胎体内模型中进行评估时，CuBG-CS不仅表现出良好的生物相容性，还显示了良好的成血管反应。
Col/BGS支架不仅具有良好的力学性能和成骨、成血管能力，还可作为释放抗菌物质的载体，为感染骨缺损的修复提供了一种新的替代方法。但BGS的力学性能相对较弱，对于一些主要承重部位大面积骨缺损的力学支持能力有限。且目前关于支架的研究多数还只停留在细胞层面，对其成骨分化的调控机制尚不明确，因此，未来仍需更多的数据验证。
3. 胶原/碳基纳米材料复合支架
3.1 胶原/碳纳米管复合支架
CNTs是由石墨烯薄片制成的碳的同位素异形体。在BTE中，CNTs因其良好的生物活性、较高的孔隙率、机械强度及柔韧性，常被用作增强材料使用。如Gerasimenko将单壁碳纳米管（single-walled carbon nanotubes,SWCNT）/Col涂布到聚对苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate,PET）纤维带表面。与纯PET和Col涂层的PET带相比，SWCNT的加入有效改善了PET带的亲水性和生物相容性。在植入兔膝关节后，SWCNT/Col组周围有明显的新骨和致密结缔组织形成。植入6个月后，骨通道直径较Col涂层组有明显缩小。进一步证实了CNTs能有效增强支架的成骨效应。
与传统的无机材料相比，CNTs具有比重低、韧性高等优点，是制备强度高、重量轻支架的理想增强材料。此外，CNTs表面具有极高的反应性，可作为结合药物、标记分子等物质的平台，达到疾病诊断和治疗的目的。但截至今日，临床上尚无基于CNTs的给药系统，一方面，CNTs的生物毒性仍存在很大的争议，其长度、厚度、比表面积、化学改性类型、催化剂的残余及体内暴露的时间都可能影响其毒性。另一方面，CNTs分散性差，难与药物直接结合，需要进行复杂的表面处理。因此，想要将CNTs应用于临床，仍需对其生物安全性及与其他材料、药物结合的机制进行进一步的研究。
3.2 胶原/氧化石墨烯复合支架
氧化石墨烯（Graphene oxide,GO）是将含氧官能团附着到石墨烯上形成的二维碳纳米片，具有良好的亲水性、较高的比表面积和稳定的力学性能。GO已被证实能够支持多种干细胞的黏附、增殖和成骨分化，很适合作为增强支架机械强度和刚度的填料。
Fang等人的实验发现，GO/Col支架的机械强度随GO浓度的增加显著提高。GO/Col支架可通过促进血管生成提高BMSCs的增殖和成骨分化能力，从而促进骨再生。Kohei的实验显示，将GO涂覆于Col支架表面后其抗压强度是原来的1.7倍。在植入大鼠颅骨缺损35天时，GO/Col支架的新生骨面积和高度分别是Col支架的2.7和2.3倍。
植入狗根分叉病变4周时，新生牙槽骨修复了大部分根分叉缺损，并很少出现GO残留。根分叉处牙周膜纤维形成良好，且均未发生根面吸收和骨性粘连。该研究进一步表明，GO/Col支架不仅在体内具有良好的成骨能力，还具有良好的生物吸收性。
除此之外，GO还具有广谱抗菌能力、较高的比表面积和易功能化等特点，使其开始在药物传递等领域逐渐崭露头角。但目前，学者们对GO促进成骨相关细胞分化的机制及信号通路尚不明确，且对其生物毒性仍存在很大争议。因此，未来仍需深入研究这类复合材料对细胞及人体的作用机制，并通过表面修饰等方法进一步改善GO的生物相容性。
4. 负载微量元素的胶原支架
在骨组织中，无机相的组成除HA外，另一个重要的成分便是微量元素，其在调节骨代谢，促进骨和血管形成的环节中都起着重要的作用。微量元素如镁（Magnesium,Mg）、锶（Strontium,Sr）等还被认为是骨生长因子的替代物。据报道，Sr具有增强成骨细胞骨形成的能力，加入骨替代物中可促进骨再生。
Chen等人利用Sr/GO对Col支架进行交联改性，与纯Col支架相比，Sr/GO/Col支架对人脂肪间充质干细胞表现出了更高的粘附性，并通过激活MAPK信号通路和增加BMP-2、VEGF的表达促进细胞成骨分化和血管生成。再将Sr/GO/Col支架植入大鼠颅骨缺损区12周后，其OPN、OCN和RUNX2的表达均高于纯Col支架，并观察到骨和血管生成。其中，Sr与细胞表面结合促进RUNX2表达在成骨分化中发挥着重要的作用。
Mg已被证明能够增强ALP活性和FGF-2的表达，促进BMSCs的增殖和成骨分化。近年来，学者发现Mg还可以通过其他途径促进成骨，如Li等人使用静电纺织技术将Col自组装于氧化镁纳米颗粒（MgO NPs）与聚己内酯（PCL）制成的骨膜绷带表面。与PCL/Col相比，MgO NPs的加入可明显促进骨膜细胞的增殖。
此外，在植入小鼠股骨皮质骨缺损表面3周时，新骨逐渐覆盖缺损区且血管生成相关细胞因子(Pdgfb)、神经生长相关因子（Tac1、Calcb、Gal）和内皮细胞标志物(Vimentin、Cd31、Endomucin)的转录水平显著升高。作者认为这可能是由于Mg2+激活内源性骨膜巨噬细胞进入M2表型，形成促进成骨微环境的同时引导血管形成和神经突长入，从而更好地实现骨缺损修复。
将微量元素引入BTE支架具有经济、制作工艺简单等优势。但在实际应用中，微量元素促进成骨具有很强的剂量和时间依赖性。高剂量或长时间的作用不仅对成骨无益，还会导致生物毒性。目前，学术界对于负载微量元素的复合支架在体内释放水平的检测及机体反应的临床观察还很匮乏，想要进一步将其应用于临床仍需深入研究这些微量元素促进骨愈合的变化过程。
5.展望
基于Col的有机-无机复合材料有效改善了纯Col支架机械强度差、降解速度快等缺点，同时在增强支架骨诱导能力方面也展现出巨大的潜能。各类无机生物材料性能不同，其与Col形成的复合支架的制备方法，产生的性能变化等也有所差异。但客观来讲，目前仍没有一种支架能在生理条件下完全恢复骨组织的结构和特性。
因此，我们在追求性能与骨组织更匹配的支架同时，仍需探索实现不同材料间快速有效的组装方法，并逐步完善体内外实验，验证这些支架用于骨缺损治疗的可行性与安全性。未来，我们仍需进一步围绕Col/无机物复合支架促进骨再生的分子作用机制展开研究，填补其在免疫调节和血管再生等领域的空白，拓展复合支架在骨再生领域的应用范围，使其能够沿着多种路径促进骨修复再生。
相信随着各类新型纳米材料、3D打印技术等在骨组织工程领域的应用拓展，在计算机辅助下设计的纳米级仿生ECM支架可以为一些空间结构复杂的骨缺损、骨病提供更好的个性化治疗。
