牙周炎是口腔常见疾病之一，也是导致成人失牙的主要原因。我国第四次全国口腔流行病学调查结果显示：35~44岁年龄组人群的牙周健康率为9.1%，55~64 岁年龄组人群的牙周健康率仅为5.0%，严重影响了我国民众的口腔健康。同时，牙周炎可以加重多种全身系统性疾病，是糖尿病、阿尔兹海默病、类风湿关节炎等疾病的高危因素。牙周炎早期症状隐匿，易被忽视，若不及时治疗则会造成软硬组织缺损。
目前，临床上的常规治疗手段，如牙周基础治疗、牙周翻瓣刮治手术等，虽然可以清除菌斑，控制炎症，但是难以实现已破坏的牙周组织再生。而牙周再生性手术，如引导组织再生术、植骨术等，虽然具有一定的临床获益率，但仍然存在临床适应证有限、可预期性差等问题。
目前临床上尚难以实现真正意义上的牙周组织再生。重建牙周组织的解剖结构和生理功能仍是学者们一直关注和致力实现的目标。本文将对目前牙周再生治疗中面临的困境做一概述，并围绕牙周再生过程中的关键要素，对其研究进展和挑战进行回顾。
1.牙周再生的困境
1.1 牙周再生涉及组织多，结构复杂
理想的牙周组织再生包括：牙槽骨形成、裸露根面上牙骨质新生，以及有序排列的sharpey’s纤维插入到固有牙槽骨和新生牙骨质中。每种组织都有其独特的结构和功能，并且相互作用协调，因而重建生理性牙周组织结构较为困难。牙周膜纤维连接牙根表面的牙骨质与牙槽骨，并将牙齿固定在牙槽窝内。要实现牙周膜纤维的改建，及其在新生牙槽骨和牙骨质间的牢固附着，仍是较大的挑战。同样，牙骨质再生的可预测性和质量也很低。
牙骨质的再生依赖于牙周膜中的细胞分化成牙骨质细胞，在原有的牙根表面沉积新的牙骨质，同时新形成的牙周膜纤维也埋入新牙骨质中，以重新建立功能性关系。理想的再生牙骨质为无细胞外源性纤维牙骨质(acellular extrinsic fiber cementum，AEFC)，由于AEFC对附着功能贡献最大，矿化程度较高。在大多数牙周再生研究中，由于新形成的牙骨质是有细胞固有纤维牙骨质(cellular intrinsic fiber cementum，CIFC)，而非理想的AEFC，CIFC中牙周膜纤维插入的密度较低，因此附着功能质量较差。
在牙周再生过程中，原有牙骨质的存在可以调控生长和矿物相关因子的表达，促进新生牙骨质的形成，因此在牙周治疗过程中，应采用轻柔、温和的治疗手法清除牙石、菌斑，尽可能减少过度刮除根面牙骨质。
1.2 目前的治疗手段促进组织再生有限
目前临床上针对牙周组织缺损的再生治疗包括引导组织再生术(guided tissue regeneration，GTR)、植骨术、生物活性因子等单独或联合应用。在牙周组织愈合过程中只有牙周膜细胞具有再生牙周组织的潜能。然而，在牙周翻瓣术后愈合过程中，牙龈上皮迅速沿根面增殖，形成长上皮结合，妨碍新附着的形成。因此GTR就是在牙周手术中利用膜性材料作为屏障，在组织修复过程中阻挡牙龈上皮向根面生长，以维持“再生的空间”，引导具有再生能力的牙周膜细胞优先占领根面，获得有牙周膜纤维埋入新生牙骨质的再生性愈合。
GTR 可以在一定程度上修复牙周组织缺损，然而治疗效果不一，可以是完全再生，也可以是部分再生，甚至没有再生。此外，治疗的适应证有限，对于Ⅱ度根分叉病变、窄而深的三壁骨下袋容易获得较理想的再生效果，而Ⅲ度根分叉病变、一壁和四壁骨下袋，仅部分病例能通过牙周再生性手术获得硬组织增量，术后效果可预测性低。
1.3 牙周微生物、炎症改变了局部或者全身免疫
牙周组织内微生物感染、菌群失调引发机体过度的炎症反应，进而导致牙周支持组织破坏。微生物失调可以增强机体破坏性炎症反应，例如激活辅助性T细胞17(T helper cell 17，Th17)分泌白细胞介素-17(interleukin 17，IL-17)，诱导成骨细胞中NF-κβ 配体受体激活因子(RANKL)的表达，导致破骨细胞活化和骨吸收。
巨噬细胞中细胞因子的表达及其表型转换与牙周炎症微环境形成、牙周组织破坏和再生密切相关，经典活化型M1型巨噬细胞主要分泌促炎因子，在炎症早期承担着宿主防御功能；在炎症减轻后的愈合过程，M2型巨噬细胞通过Th2细胞因子如IL-4、IL-13 及免疫复合物进行活化，M2分泌抑炎因子，促进牙周组织的修复再生。而牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)可以阻断巨噬细胞M1型向M2型转化，将巨噬细胞“锁定”为M1型，使组织微环境中具有修复和免疫调节功能的M2型巨噬细胞数量减少。
微生物感染和随之而来的宿主免疫反应形成一个独特微环境，影响局部的牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)的功能，而有研究报道受损的PDLSC也会通过加重宿主免疫反应，促进破骨细胞活性，形成一个“正反馈”的恶性循环。另外，牙周微生物及其代谢物通过多种机制调节全身免疫炎症反应。Pg 可增加IL-1β等多种炎症因子的表达，促进系统性炎症反应发生。严重牙周炎患者血液中的促炎因子，如IL-1β、IL-6、C反应蛋白(CRP)等升高，中性粒细胞数量增加，全身免疫又会改变局部牙周组织对感染的应答反应，促进局部炎性介质的产生，影响牙周组织的再生。
1.4 炎症及衰老环境下干细胞数量减少、功能受损
干细胞功能和数量对维持组织稳态和修复损伤至关重要，而其又依赖于与微环境的相互作用。来自健康牙周膜组织的PDLSCs具有免疫调节和牙周组织再生特性，而来自炎症牙周膜组织的PDLSCs则出现明显的免疫调节功能失调，导致破骨细胞生成加速和免疫反应失衡；与健康组织相比，炎症环境下牙周膜中的干细胞矿化结节形成能力下降。同样，在衰老过程中干细胞的再生和分化潜力也出现下降。
干细胞中DNA 突变随着时间的推移自然累积，而机体可以识别清除这些受损细胞，而这种修复机制也同时减少了干细胞的数量，对组织内稳态和愈合再生能力产生了影响。衰老的PDLSCs增殖速度降低，衰老标记物p16表达增加，促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α上升，影响牙周再生功能。
2.牙周再生的关键要素和治疗策略
牙周再生治疗需要4个关键要素：安全有效的干细胞来源、充足的血液供应、稳定的再生空间以及在时间、空间上有序释放的多种生长因子。在控制炎症的基础上，上述关键要素为牙周组织再生提供良好的微环境。本文将从上述牙周再生中的关键问题切入，结合近年来的研究进展，探讨牙周再生过程中面临的挑战和可能的解决方案。
2.1 控制感染、减轻炎症
牙周再生治疗并不能治疗牙周炎，而是修复牙周炎所造成的软硬组织缺损使其获得新附着。在开始牙周再生治疗之前，必须先进行完善的牙周基础治疗，确保患者已建立良好的菌斑控制习惯。牙周再生治疗的疗效与术前、术后牙周炎症控制水平有关。若菌斑长时间控制不佳，探诊出血水平较高，以及持续的高细菌总量或特定致病菌都会影响再生治疗的效果。放置植入材料前也要尽可能实现彻底清创，为牙周组织再生创造适宜的免疫微环境。
2.2 获得具有再生潜能的细胞
现有的临床治疗方法不能完全实现牙周组织再生，随着再生医学的深入研究，干细胞移植、内源性再生成为人们关注的焦点。胚胎干细胞虽具有明显的再生分化能力，但由于其伦理问题限制了临床转化。成体干细胞获取容易，是牙周再生领域的研究热点。牙源性干细胞在牙周组织再生方面优于非牙源性干细胞，其中PDLSCs由于其可向成牙骨质、成骨、牙周膜方向分化，成为牙周再生治疗中首选种子细胞。
其他的牙源性干细胞，如牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)、牙囊干细胞(dental follicle stem cells，DFSCs)、脱落乳牙干细胞(stem cells fromhuman exfoliated deciduous teeth，SHEDs)、根尖乳头干细胞(stem cells from apical papilla，SCAPs)等，也在大量研究中被证实可以促进牙周组织再生。此外，在牙周缺损局部植入非牙源性干细胞，如骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)和脂肪干细胞(adipose tissue-derived stem cells，ADSCs)等，也在各种牙周缺损模型中被证实有促进牙周组织缺损修复的作用。
干细胞移植用于牙周再生治疗已开展多项临床研究，具有一定的临床获益性，但有效性仍无法达到预期。如何充分提高植入细胞的利用率、优化植入细胞再生潜能是亟待解决的问题。细胞膜片(cell sheets)技术因细胞密度可控、细胞外基质(extracellular matrix，ECM)保留、安全性能更佳而成为近年组织工程领域的研究热点。
细胞膜片是包含完整的ECM 和细胞表面蛋白(如生长因子受体、离子通道和细胞间连接蛋白)的层状细胞结构。多种细胞来源，如自体细胞、同种异体细胞等均可制备细胞膜片。细胞膜片作为新型组织工程技术已被有效地应用于骨、角膜、心脏、气管和牙周组织的再生治疗中。
近年来，“内源性再生”策略在牙周再生领域得到了广泛的关注和研究。牙周内源性再生通过招募机体内源性干细胞归巢，定向到牙周缺损区域发挥再生和免疫调节功能。通过释放生物活性因子，如干细胞动员因子P物质、基质衍生因子-1α(stromal derived factor-1α，SDF-1α)和干细胞因子(stem cell factor，SCF) 等趋化因子诱导内源性细胞归巢，接着通过生物材料的设计，包括合成细胞外基质模拟材料和一些生长因子，提供适宜的细胞生长微环境，促进归巢干细胞增殖、分化，发挥更好的再生功能。精确调控募集细胞的生物材料也是未来重要的研究方向，为牙周再生提供新的思路。
2.3 维持稳定的再生空间
2.3.1 屏障膜的使用
为了避免牙龈上皮和结缔组织在根面迅速增殖形成长上皮结合妨碍新附着的形成，屏障膜的隔离作用是GTR 的关键。屏障膜材料需要具备以下基本功能：(1)阻挡上皮细胞进入；(2)保持形状以及完整性，以维持其在牙根表面所创造的空间；(3)良好的生物相容性。临床上用于GTR的屏障膜分为可吸收和不可吸收膜。
不可吸收膜以膨体聚四氟乙烯(e-PTEE)屏障膜为代表，具有良好的空间维持作用。但因其不可吸收的特点，在手术后6~8周需要二次手术取出。同时，不可吸收膜容易暴露于口腔环境中，增加术后感染风险。可吸收屏障膜具有良好的生物相容性，但是其机械强度较差，容易塌陷。因此，常常需要在骨缺损内植入骨粉等支架材料，这些支架材料在一定程度上能够防止屏障膜的塌陷，使屏障膜保持于原位。
2.3.2 植入支架材料
在引导组织再生的同时，通常会结合植骨术，即采用骨或骨替代材料促进新骨形成，恢复牙槽骨的解剖形态。很多植骨材料仅为新骨形成提供支架作用，即仅具有骨引导性，获得组织再生的效果有限。而有一些植骨材料具有骨诱导能力，可以促进细胞生长或成骨分化，即具有骨诱导性，植入后可以刺激牙槽骨的再生。具有骨再生性的骨移植物指含有骨形成细胞，目前只有自体骨具有骨再生性。
临床上使用的各种植骨材料可分为4类：
(1)自体骨：其口内供区常见为颏部或磨牙后区，或在邻近术区的自体骨；口外供区常见为髂嵴。目前，自体骨移植可以获得最佳的牙周再生效果，但是其获取量有限，有时需要第二术区。
(2)同种异体骨：通常来源于遗体捐献，目前临床上的同种异体骨主要为冻干异体骨(freeze dried bone allografts，FDBA)和脱钙冻干异体骨(demineralized freeze dried allografts，DFDBA)，同种异体骨具有骨引导功能和一定的骨诱导性。
(3)异种骨：来源于动物骨组织，如临床上常用的Bio-oss骨粉即为牛源性无机骨矿物质，异种骨材料一般仅具有骨引导性，且吸收缓慢。
(4)异质性移植物：为合成或无机的移植材料，研究较多的包括羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)、β-磷酸三钙和β-磷酸三钙和HA 混合得到的双相磷酸钙，以及壳聚糖、胶原等聚合物，可以用作骨移植材料的替代物，通常也仅具有骨引导性。
为了实现更好的再生效果，很多研究致力于构建一个结构良好的支架材料引导合适的细胞和蛋白在一定区域聚集，建立良好的再生微环境。支架材料主要作为细胞附着、组织向内生长的基质，以及最初的结构支撑。
近来一系列新兴支架系统被不断开发以更好地应用于牙周组织再生，主要包括以下几类：
(1)使用3D打印、多相支架设计、静电纺丝技术等，以更好地实现牙周多组织再生。3D生物打印是3D打印与组织工程技术相结合的新兴技术，可通过定制以适合于不同的牙周缺损处。有学者通过3D打印可降解支架实现比格犬牙周组织再生。通过计算机辅助设计建模模拟天然组织，构建具有缺损特异性的个性化三维组织结构，能够控制细胞和生物活性分子在复杂组织结构中的递送，有望实现组织再生的突破。
(2)联合抗菌成分，在牙周炎症环境下具有抗菌性能以获得更好的再生微环境。
(3)更好地负载、释放生物活性分子，尽可能模拟组织修复过程中生物活性因子在时间、空间上的有序释放。
(4)具有更好的降解性能，为新生组织提供空间。目前，并没有一种单一的植入材料可以持续地引导多种组织协同再生，特别是在较大的牙周缺损中。有学者提出“牙槽骨-牙周膜-牙骨质的分层仿生膜片”的概念，但还处于实验室研究阶段。
2.4 生物活性因子
生物活性因子可以调控细胞增殖分化和免疫调节，促进牙周组织的再生和修复。目前研究发现促进牙周再生的生物活性因子包括血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、釉基质蛋白衍生物(enamel matrix derivate，EMD)和骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins， BMPs)等。PDGF是一种由血小板释放的生物活性因子，能够促进成骨细胞和成牙骨质细胞的增殖和分化，以及细胞外基质的合成和修复，从而促进牙周组织的再生。大量研究结果显示重组人PDGF-BB可以促进牙周缺损的修复和附着水平的增加。
EMD是一种从牙釉质中提取的蛋白质混合物，主要成分是釉基质蛋白(enamel matrix protein，EMP)。20世纪90年代，Hammarström 及其同事对牙周炎患者的患牙实施根面平整术后，将 EMD涂布到根面上，结果发现EMD 具有促进牙周组织再生的能力。近年来，越来越多的研究证明了EMD在牙周再生中的积极作用。EMD 可以促进成骨细胞的增殖和分化，同时抑制炎症环境下促炎因子的水平，促进牙周组织的再生和修复。其商业化产品Emdogain是一种从猪提取的含有EMD 的纯化酸，已经得到了广泛的应用。BMPs属于多功能多肽，具有较强的促进骨修复和再生作用。
BMP-2和BMP-4在牙胚、成牙本质细胞层和其他颌面部结构发育中发挥重要作用，BMP-7不仅可以刺激牙周和种植体周围的骨再生，也可以促进上颌窦底提升术中的骨再生。负载了重组人BMP-2的可吸收胶原海绵可明显增加其对牙周骨缺损的修复作用。血小板衍生制品是由患者自体外周血液提取后离心获得的富含生长因子的血小板浓缩制剂，应用较多的有富血小板纤维蛋白(platelet rich fibrin，PRF)和浓缩生长因子(concentrate growth factors，CGF)。单独或与植骨材料联合使用可促进牙周再生。尽管不同研究之间存在差异，但大多数研究都观察到其积极作用，包括牙周袋深度降低、临床附着水平增加以及牙周缺损区域骨再生。
生长因子在牙周缺损处局部使用具有良好的前景，但是目前还未达到牙周组织工程预期的目标。研究者们发现生物活性因子蛋白被用于目标位点时，会变得不稳定，并很快被稀释。因此，重组生物活性因子的半衰期很短，对成骨细胞、成牙骨质细胞或牙周膜细胞的作用有限。各种生长因子在牙周再生中具有不同作用，如何通过基因技术调控各种生长因子释放时间、剂量，优化各种生长因子的配伍达到最佳的再生效果也是需要继续深入研究。基因治疗是通过基因转染技术，增加、抑制或修饰特定基因在受损的牙周组织中表达，以促进组织修复和再生。
尽管将重组人生长因子应用于牙周再生的临床研究已经取得了一系列重要进展，但是现有的蛋白载体具有局限性，如生物活性短暂、蛋白酶失活和生物利用率低等。目前基因治疗已成功地将生长因子基因，如PDGF和BMP转染至牙周病损处。这种基因转移方法能够避免蛋白向软组织损伤处转运过程中的许多局限性。
与单独应用生物活性蛋白相比，通过基因治疗的方法可以使生长因子或可溶性细胞因子受体所产生的作用更持久，可以更好地提高生长因子的生物利用率，以发挥更好的再生潜能。基于外泌体的生长因子在牙周再生中的作用也得到广泛关注。
越来越多的证据支持MSCs在再生中的作用可能不是通过在损伤部位直接增殖和分化，而主要是通过旁分泌途径实现。外泌体/细胞外囊泡(EVs)是来自细胞的脂质双分子颗粒，含有生物活性分子、功能性RNA(mRNA、miRNA)等成分，可以调节多项细胞功能，在组织再生中发挥着重要作用。用于牙周再生的外泌体主要是干细胞外泌体，其中包括牙源性干细胞外泌体和非牙源性外泌体，具有促进细胞增殖、成骨分化、局部新生血管形成，改善局部免疫微环境的作用。
在体内研究中，一般通过注射或者由支架、生物膜、生物材料等负载放置于缺损部位发挥功能。外泌体不仅具有与母体细胞类似的功能，而且具有免疫原性低、生物相容性好、易于功能化修饰、不良反应小等优点。作为一种无细胞疗法，MSC 衍生的细胞外囊泡(MSCEVs)在稳定性、免疫排斥、伦理监督等问题上具有一定优势，因此具有广阔的临床应用前景。
2.5 获得充足的血液供应
在组织再生过程中，充足的血液供应影响着组织的愈合。血液中含有许多细胞和生物因子，如果牙周组织没有获得充足的血液供应，这些细胞和生物因子就无法到达受损组织，从而影响牙周再生的效果。为了获得充足的血液供应，一方面，尽量保存和利用组织固有血管，例如采用微创手术(minimally invasive surgery，MIS)最大限度地减少组织瓣的创伤反应，维持关键的血供，稳定术创部位的血凝块，减少术后牙龈退缩，促进牙周组织愈合再生。
另一方面，利用生物活性分子促进血管新生，如在移植材料中加入重组人PDGFBB、EMD、BMPs、PRF、CGF 等促进新生血管的生长因子。但目前相关的研究有限，关于血管新生至何种程度适宜牙周各组织功能性再生，既获得充足的血液供应，又不过度增生形成肉芽组织，仍需进一步研究其调控机制和方法。
3.总结与展望
牙周再生是一项复杂的多因子调控的过程，目前常见的临床治疗策略成功率仍然有限，因此需要提高牙周再生的可预测性。新型的组织工程方法是牙周再生领域的研究热点，包括外源性干细胞的移植和内源性再生、开发新型支架材料、据根再生需求时序性地释放生物活性因子、调控微环境和基因治疗等，这些新的研究和技术取得了令人欣喜的进展，但其临床转化应用仍面临挑战。
