乳牙牙髓干细胞的研究进展

2017-5-15 11:05  来源:中华口腔医学研究杂志(电子版)
作者:李思洁 赵玮 阅读量:2126

    乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated decid-uous teeth,SHED)是早期外胚叶间充质组织头部的神经嵴细胞迁移衍生出的牙髓间充质干细胞。2003年,Miura等在7~8岁儿童的脱落乳牙牙髓中分离出具有高度的单克隆能力、增殖能力、体内成骨等能力的多能干细胞,并命名为SHED。之后,多项研究进一步表明SHED具有成骨分化、成脂分化、神经细胞方向分化等多向分化潜能。且乳牙牙髓被视为生物废弃物,数量可观,符合伦理要求,因而渐渐成为干细胞领域的研究热点。本文就SHED的基本生物学特征、培养方法与鉴定方法、多向分化潜能及其在疾病治疗中的应用的研究进展作一综述。
    一、乳牙牙髓干细胞的基本生物学特征
    目前认为,检验干细胞主要依据以下2种干细胞特性:(1)自我更新能力;(2)产生能分化成具有专一功能的祖细胞的能力。SHED即具备以上2 种特征,且与牙髓干细胞(dental pulp stem cell,DPSC)相比,SHED具有更强的增殖能力、自我更新能力、多向分化能力;且SHED端粒酶的长度为DPSC的2倍,预示其细胞活性远高于后者。此外,多项研究显示,通过改变SHED培养环境,可改变SHED的增殖分化能力,如低强度的激光疗法(5 J/cm2)对营养缺乏情况下的SHED增殖起明显的促进作用;经一定剂量的红外线LED照射后,SHED细胞活性与成骨分化能力显著增加;而洗必泰对SHED的增殖则起抑制作用,这将有助于人们未来将其应用于临床。研究显示,经深低温储存的SHED增殖速率、端粒酶活性及多向分化能力与自组织中提取出的新鲜SHED无异,这为乳牙牙髓干细胞库的建立提供条件,为多种疾病的治疗提供希望。
    二、乳牙牙髓干细胞的培养和鉴定培养
    环境是干细胞研究的难题之一,目前常用的干细胞培养方法主要是参考Miura等的方法。其实验步骤为将脱落的乳牙放入预冷的培养液中送至实验室并用含双抗的磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗,劈开牙冠取出冠部牙髓,PBS反复冲洗,将牙髓组织剪成1 mm3大小的小块,用3 g/LⅠ型胶原酶及4 g/L中性蛋白酶于37 ℃下消化1h,应用70 μm滤膜过滤得到单细胞悬液,在含有体积分数为20%胎牛血清的α-MEM培养基中生长,3 d后半量换液,后每2~3 d更换培养基,待细胞长至70% ~ 80%时,用0.25%的胰酶进行消化,离心弃上清液后将沉淀按1∶3进行传代,实验中应用相差显微镜可观测到明显的集落形成及成纤维细胞样形态的SHED。
    学术界常利用干细胞表面的特异性标记物对其进行鉴定。其中STRO-1是早期间充质干细胞的标志物,是目前常用的鉴别SHED的基础。STRO-1(+)细胞被证实为更原始的细胞亚群,具有强大的造血支持和在动物模型中的归巢能力,多分布于牙髓血管周围,提示大部分SHED可能来源于血管周微环境。此外,STRO-1(+)细胞的细胞增殖与分化潜能远远优于STRO-1(-)细胞,因此对SHED进一步研究与临床应用前多分选出STRO-1(+)细胞。SHED由第2代传至第14代时,STRO-1(+)表达率由25.4%降到1.4%,且细胞的多形性减低,呈现出成纤维细胞样形态,细胞体积变大,颜色变深,提示传代多次后,低分化的干细胞大部分成熟分化,因此多选用第2代至第4代的STRO-1(+)细胞进行实验[14]。此外,SHED亦表达包括CD146、CD90、CD105、CD29、CD73等多种间充质干细胞特异性分子标记,不表达造血系统来源的表面特异性分子标记CD45、CD14、CD34及内皮细胞表面特异性分子标记CD31,其表达与其他间充质来源的干细胞表面标记高度类似。SHED亦表达基质相关标记物和血管相关标记物,如碱性磷酸酶、糖蛋白、碱性成纤维细胞生长因子和内皮抑制素等。
    三、乳牙牙髓干细胞的分化潜能及其在疾病治疗中的应用
    SHED具有多向分化潜能,在不同的介质诱导下可分化为不同的细胞,目前已发现其可向神经样细胞、脂肪细胞、肝肾细胞、成骨细胞等分化。在不同的微环境下,SHED表现出特定的分化特征,且通过改变微环境的条件,可增强或抑制其分化能力,如同种异体的富含血小板的血浆对SHED的增殖与分化起促进作用,而洗必泰可抑制SHED多向分化能力。多个前期临床实验显示,SHED 可通过抗炎效应、抗凋亡效应与旁分泌效应在自身免疫性疾病、骨缺损、皮肤溃疡、脊髓损伤与新生儿缺血缺氧综合征等疾病中起治疗作用。因此,越来越多的研究者专注于研究SHED的分化潜能及其在疾病治疗中的作用,包括骨缺损、肝肾疾病、神经系统性疾病、自身免疫性疾病等,期望获得新突破。
    1.成骨分化能力及在骨缺损的修复中的研究:
    此前,已有多项体外实验研究显示SHED具有明显的成骨诱导分化能力。Nourbakhsh 等发现,采用矿化诱导液对SHED进行诱导,在第10天即可以观察到茜素红染色阳性的红色矿化结节,且反转录聚合酶链反应(RT-PCR)显示骨钙蛋白(osteocalcin)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、甲状旁腺素受体(parathyroid hormone receptor,PTHR)和骨调素(osteopontin)等多种骨细胞标记物均表达,表明SHED可发生成骨分化。Zheng等将小型猪的SHED与β-CP(β-磷酸钙)移植入猪的下颌骨缺损区,6个月后观察到该区出现骨组织,实验结果表明,猪的SHED具有较强的形成新骨的能力且其形成速度明显较快。Seo 等以羟基磷灰石/磷酸三钙为基质将SHED移植入免疫缺陷小鼠中以修复颅骨缺损区,实验显示该区存在骨组织形成。但是,尚无研究报道明确修复缺失骨所需的SHED的量。
    2.神经细胞向分化及在神经系统疾病治疗中的应用:
    神经细胞在疾病或外伤后缺乏自我更新分化的能力,影响正常功能的行使。多年以来,人们在积极寻找能代替或修复其功能的方法,包括补充神经元营养因子、基因疗法、细胞疗法等。有研究显示,在体外诱导条件下,SHED可检测到神经嵴的表型,且分化出神经元形态。Nourbakhsh等通过体外实验对SHED进行神经诱导,免疫荧光染色法、流式细胞术及Western实验发现,该培养液中神经前体细胞的早期标志巢蛋白(nestin)持续高表达,表达量几乎不变[(90.7±8.4)% vs.(95.3±2.9)%],而神经元特异标志物-神经元核(neuronal nuclei,NeuN)、交感神经特异性标记物酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)和神经胶质特异性抗原-胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein,GFAP)等的表达量则显著增加,镜下发现细胞分化为神经元样形态,突起伸出。这些结果均表明,SHED能够分化为神经样细胞。实验同时证实神经诱导液中添加bFGF、SHH/FGF8可对其分化起促进作用,此外,含施万细胞的神经诱导液对SHED具有较强的成神经细胞诱导能力,免疫组化染色与RT-PCR显示细胞表面均表达特异性神经标记物。
    有研究将SHED应用于帕金森氏病的治疗研究中,并取得良好成效。此前,已有研究发现,SHED可被含EGF和bFGF的神经诱导液诱导为神经球(SHED-derived spheres),而该种细胞在特定培养液中可进一步分化为多巴胺能神经元样细胞。2006年,Suon等将诱导而来的多巴胺能神经元样细胞移植入患有帕金森氏病的动物的纹状体中,发现其并不起作用,认为可能系该植入细胞为完全分化的终末细胞所致。
    2010年,Wang等进一步改善实验,实验选用诱导前期细胞即SHED及其诱导而成的神经球植入纹状体,结果发现植入部位存在高表达TH的神经球细胞。且与SHED组相比较,神经球组TH阳性细胞率较高,神经突较后者明显长且多,其中尤以TH阳性细胞神经突最为明显。两组神经症状均得到改善,且神经球组效果更显著。提示,SHED可望用于治疗帕金森氏病,且将SHED进行体外诱导分化后方移入可能可提高其分化能力。
    3.肝肾细胞向分化及在肝肾疾病治疗中的应用:
    SHED经恰当的刺激亦可表达一系列肝细胞标记物,如肝细胞核因子4α(hepatic nuclear factor-4α)、α-甲胎蛋白(α-etoprotein)、胰岛素生长因子1(insulin-like growth factor-1),且其中90%的细胞可表达白蛋白,此外培养液中尿素水平显著增加、细胞内糖原堆积,表明SHED亦可分化为肝细胞。该实验同时发现在培养液中添加甘草或当归萃取物可提高其分化能力。这表明SHED可望用于肝癌或肝硬化等疾病治疗。Yamaza等将小鼠肝脏采用四氯化物诱导产生肝纤维化后将SHED移植其中,发现SHED可通过组织重生、抗炎反应与抗纤维反应等促进肝脏愈合。亦有研究显示,SHED可减轻自身抗体和血清肌酐酸水平以及蛋白尿的量。
    Hattori等发现SHED可对缺血性肾损伤起治疗作用。缺血性肾损伤发生时,肾上皮细胞分泌促炎性趋化因子,包括MIP-1、MIP-2,后者促进巨噬细胞、白细胞浸润,从而造成缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI),此外,巨噬细胞分泌的IL-1β亦参与炎性反应。Hattori等在实验时通过钳夹鼠左侧肾动静脉20 min以造成缺血性肾脏损伤,之后将SHED注射入损伤的肾包膜下,发现肾中巨噬细胞与中性粒细胞浸润减少,细胞因子MIP-2、IL-1β和MIP-1显著减少,HGF分泌增加,减少炎细胞的数量及器官纤维化,从而加速创伤的愈合。SHED组血清肌酐和尿素水平显著低于BMMSC组和空白对照组。然而SHED对肾脏的保护作用尚未有进一步研究。
    4.免疫调节功能:
    有充分的研究证据显示,MSC可通过躲避免疫识别,减少免疫排斥反应的发生,亦可通过与包括T、B淋巴细胞、树突状细胞(dendritic cell,DC)、自然杀伤细胞在内的多个免疫细胞相互作用而调节机体的免疫应答。因而MSC可用于预防或治疗造血干细胞或器官移植后的排斥反应,治疗自身免疫疾病或炎症反应类疾病。那么,SHED是否亦具有同样的功能呢?Alipour等通过体外实验发现,SHED 能抑制人激活型T淋巴细胞的增殖。Yamaza等将SHED移植入患SLE相关性疾病的MRL/lpr鼠中,实验发现SHED可通过激活TGF-β、ERK、Akt、Wnt和PDGF等多个信号通路,从而抑制Th17细胞,增加调节性T细胞的数量,达到治疗的作用。
    Silva Fde等则将SHED与DC 进行共培养,通过检测成熟DC 表面标记物以检测SHED对DC成熟与分化的影响。实验显示,其表面标记物中共刺激因子的表达水平较对照组显著减少,CD14表达水平增高(DC处于非成熟状态时,表达低水平的共刺激因子、高水平的CD14,前者对DC免疫功能起重要作用),且共培养液中促炎性因子白细胞介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和干扰素γ(IFN-γ)分泌显著减少,抗炎性因子IL-10显著增加,表明SHED可抑制DC的成熟与分化,抑制炎症因子的产生。此外,实验将与SHED共培养的DC分离后与淋巴细胞进行共培养,发现CD4+ T和CD8+ T细胞的增殖速率显著降低,CD4+Foxp3+IL-10+调节性T细胞数量增加(抑制T细胞、B细胞的分化及功能行使)。该实验表明,SHED可通过抑制DC的成熟与分化,抑制其激活T淋巴细胞的能力,从而对免疫系统发挥调节作用。
    四、展望
    SHED 自被分离以来因具有高增殖能力、自我更新能力、多向分化潜能而备受关注。越来越多的人专注研究其多向分化潜能及在组织器官修复、疾病治疗中可能发挥的作用,结合上述已知SHED可望应用于骨组织再生、肝肾疾病、神经系统性疾病、自身免疫性疾病等疾病治疗,尽管目前SHED发挥作用的分子机制尚不完全被阐明,相关研究尚处于进行阶段,但是,随着越来越多的大量动物实验的研究,SHED将在未来多种疾病治疗领域产生深远而重大的影响。

编辑: 陆美凤

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