口腔来源外泌体研究进展

2018-7-11 10:07 来源:中国实用口腔科杂志
作者:史亚方 彭文英 林莉阅读量:10500

    细胞和细菌都能够分泌胞外囊泡,这些囊泡经过循环被其他细胞摄取,通过一系列的机制被完好保存,被称为下面几个不同的名称:脱落的囊泡、外泌体(exosome)、膜囊泡(membrane vesicle,MV)、外膜囊泡(outer membrane vesicle,OMV)。外泌体这个术语首先是用于描述免疫细胞释放的膜性囊泡,然后逐渐扩展到其他的细胞类型,包括肿瘤细胞。

    目前,外泌体是指从各种类型细胞中分泌的直径为40~100nm的细胞外囊泡。外泌体内含有来自细胞的脂质、蛋白质、核酸,通过质膜融合、表面受体介导的摄取、受体细胞内化等机制被装载到受体细胞,影响其功能和活动。几乎所有类型的细胞都能分泌外泌体,比如上皮细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞、血小板等,从血浆、尿液、母乳、精液、羊水、唾液以及病理性的肿瘤积液中也可以分离出外泌体。

    外泌体具有多效的生物学功能,包括调节免疫活性、介导细胞间通讯和运送感染性物质等。外泌体中包含的RNA和miRNA可以随外泌体转移到另一个细胞,并在受体细胞中被翻译,表明外泌体是遗传交换的新载体。近年来,各领域都开始对外泌体展开研究,口腔领域主要对唾液、口腔癌和牙周致病菌来源的外泌体进行了研究,本文对其进行简要综述,总结口腔相关外泌体的研究进展。

    1.唾液来源外泌体

    唾液中含有多种分子和微生物,是局部和全身状况的有效分析指标。血源性分子经由跨细胞或旁细胞途径进入唾液,影响唾液的成分。有研究发现,唾液中的miRNA表达谱与血清中相似。唾液蛋白和牙周病、艾滋病以及自身免疫性疾病的关联已经被证明。由于唾液收集具有非侵入性、低成本、简单安全的特点,其内又含有对监测疾病有用的蛋白质,所以唾液是用于早期疾病诊断和监测的一种理想液体。用基于质谱分析的鸟枪法蛋白质组学方法研究发现,腮腺唾液的大部分蛋白质来自唾液外泌体。

    利用多维蛋白质质谱分析,在腮腺唾液外泌体中分离了491种蛋白质,其中有265种蛋白质与腮腺导管唾液中发现的蛋白质一致,72种与之前在尿液中分离的外泌体蛋白质一致,这些蛋白质与来自其他组织和细胞的外泌体蛋白也有部分一致。基因分析和KEGG通路分析发现,腮腺唾液外泌体蛋白质中胞质蛋白组成了大部分,这些蛋白质涉及磷脂酰肌醇信号系统、钙信号通路、肌醇代谢、蛋白质输出和信号转导、质膜蛋白和上皮细胞信号传导、T细胞和B细胞受体信号传导、细胞因子受体相互作用以及抗原加工和呈递等。因此,腮腺可以分泌反映腺体代谢和功能状态的外泌体,这些外泌体携带的蛋白质可用于诊断和治疗系统性疾病。

    用超速离心法提取分离全唾液的外泌体,微阵列分析显示,509个mRNA核心转录产物相对稳定地存在于外泌体中。在体外,荧光标记的唾液外泌体可与口腔角质形成细胞通信,将外泌体的遗传信息转移到角质形成细胞,改变基因表达。提示唾液外泌体中的mRNA可用于疾病诊断。唾液外泌体miRNA作为一种诊断标志可避免来自死细胞或者唾液中其他免疫细胞的核酸干扰造成的假阳性结果。有研究比较了16例口腔扁平苔藓患者和8名健康对照者的唾液外泌体miRNA谱,微阵列分析和定量PCR分析显示,miR-4484在唾液外泌体中显著上调,这提示miR-4484可能是口腔扁平苔藓(萎缩型、糜烂型)的潜在生物标志物。

    Machida等在无刺激的情况下收集15名年轻人和13名老年人的全唾液,分离外泌体,提取RNA,比较唾液外泌体RNA的变化。该研究通过微阵列分析检测到242个miRNA,其中6种miRNA有明显的变化,进一步通过实时定量PCR验证,唾液外泌体中的miR-24-3p可能是衰老的一个生物标记物。所有年龄相关的疾病都与衰老有关,这些疾病相互影响,时间的推移本身并不是老化的最佳衡量标准,老化生物标志物的发展对于明确衰老和疾病过程很重要。

    唾液外泌体中的miRNA也可以成为疾病治疗的靶标。ebv-miR-BART13-3p是一种功能性miRNA,可通过外泌体从B细胞转移到唾液上皮细胞中,下调STIM1蛋白,影响唾液分泌所需的关键Ca2+进入机制;ebv-miRBART13-3p也下调AQP5的表达,AQP5是位于极化的人唾液腺腺泡细胞顶端膜上的重要水通道。研究表明,ebvmiR-BART13-3p与唾液分泌丧失有关,外泌体负载的ebv-miR-BART13-3p可能是改善舍格伦综合征患者口腔干燥症的治疗靶标。还有研究发现,外泌体负载间充质特异的成熟miRNA,从间充质向上皮传递遗传基因。

    小鼠下颌下腺来源的外泌体,负载miR-133b-3p,可以从间充质转移到不表达miR-133b-3p的唾液上皮;在外泌体中敲除miR-133b-3p,可以减少上皮kit阳性祖细胞的增殖,增加DIP2B的表达。DIP2B涉及DNA甲基化等过程,外泌体从间充质到上皮的过程中携带miR-133b-3p,可以减少DIP2B的表达,影响祖细胞的扩增,这提示外泌体介导的上皮间充质转换过程可能成为诱导受损成人器官再生的靶标。

    目前,还倾向于研究唾液外泌体与远端疾病如何相关联。唾液来源外泌体内包含有可能影响免疫应答的二肽基肽酶Ⅳ(DPPⅣ)、半乳糖凝集素-3和免疫球蛋白A,这些囊泡可能参与生物活性肽的分解,在口腔局部免疫防御中发挥调节作用。有研究通过在体外建立乳腺癌模型发现,乳腺癌来源的外泌体可以被唾液腺细胞摄取,激活唾液腺细胞的转录机制,从而在转录和蛋白质组学上改变唾液外泌体的成分。还有研究发现,胰腺癌小鼠唾液外泌体可以与NK细胞直接作用,降低NK细胞的杀伤能力,导致NK细胞的抗肿瘤免疫逃逸,这为肿瘤的发展过程提供了一个新的见解。

    2.口腔癌来源外泌体

    肿瘤细胞来源的外泌体正在成为早期检测和控制人类癌症的潜在工具。一些研究证明,肿瘤细胞来源的外泌体可以通过诱导肿瘤细胞凋亡或增强抗肿瘤免疫而具有抗肿瘤特性。另有研究发现,肿瘤细胞来源的外泌体具有免疫抑制性,可以刺激肿瘤细胞增殖或诱导耐药性,促进肿瘤进展、侵袭和转移。头颈部鳞状细胞癌是第七大常见的恶性肿瘤,年发病率大于60万分之一,其中有一半位于口腔。尽管治疗方法和技术取得了显著的进展,在近20年来,其5年生存率一直在50%左右,而且容易复发,原位癌复发率约为10%~30%,转移癌发生率高达30%。

    虽然头颈部鳞状细胞癌是一种潜在的可治愈的恶性肿瘤,并且具有早期诊断的特征,但患者往往发现时已经被诊断为接近癌症晚期的类型,因此迫切需要发现一种新的口腔癌诊断模式。口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)患者唾液来源外泌体可用来探索OSCC前期和早期的进展。纳米粒子跟踪分析显示,OSCC患者唾液来源外泌体比健康人唾液来源外泌体每毫升有更高浓度的纳米颗粒和模式纳米颗粒尺寸;用ELISA和Western检测外泌体标记物显示,CD63表达升高,CD81和CD9表达降低。

    OSCC患者唾液来源外泌体在形态和分子结构上与健康人唾液来源外泌体不同,这提供了一个基线数据,可以利用外泌体来监测OSCC的早期变化。而且,用原子显微镜观察发现了更细微的变化。用高分辨力原子显微镜观察发现,口腔癌患者的唾液中含有更多的外泌体,形态不规则,大小增加,囊泡内聚增加;对于单个的外泌体来说,口腔癌患者唾液外泌体表面标记物CD63密度增加。

    超灵敏的低原子力显微镜可以显示亚结构组织,OSCC患者唾液单个外泌体显示出可逆的机械变形,具有70~100nm三角膜形态特殊跨膜受体的亚结构。以上这些提示,外泌体的定量纳米形态学、生物力学和表面生物分子性质可以用于OSCC监测以及开发新的细胞递送系统。除了可以作为OSCC早期监测指标,OSCC外泌体也参与其侵袭和转移。OSCC细胞来源的外泌体能够被OSCC细胞自身吸收,并且通过活化PI3K/Akt、MAPK/ERK和JNK-1/2途径,显著促进肿瘤增殖、迁移和侵入。

    PI3K、ERK-1/2和JNK-1/2的药物抑制剂可以明显减弱这个过程。用来自高度侵袭性的舌癌细胞SQUU-B的外泌体处理非侵袭性的舌癌细胞SQUU-A发现,外泌体介导的相互作用决定了OSCC的侵袭性和器官性转移;经过测序分析后发现,外泌体中的miR-200c-3p调控了OSCC细胞的侵袭。外泌体也可通过与肿瘤周围基质组织沟通来促进肿瘤增殖和血管生成,激活预转移的位点。外泌体是肿瘤微环境的重要组成成分,对正常和缺氧OSCC来源的外泌体进行miRNA测序显示,低氧条件下改变最显著的miRNA是miR-21。

    降低外泌体中的miR-21水平,可显著降低肿瘤细胞的迁移和侵袭。外泌体中的miR-21可增强OSCC细胞波形蛋白的表达,降低E-钙黏蛋白水平。循环外泌体的miR-21水平与OSCC患者的HIF-1α/HIF-2α表达、T分期和淋巴结转移密切相关。提示来源于缺氧环境的OSCC外泌体以HIF-1α和HIF-2α依赖性方式增加OSCC细胞的迁移和侵袭,缺氧微环境可能刺激肿瘤细胞产生富含miR-21的外泌体,将其递送至含氧量正常的细胞并促进其转移。因外泌体参与OSCC的侵袭和转移过程,阻断外泌体的摄取途径可能对癌症治疗有效,硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPGs)是癌细胞的外泌体受体,其摄取途径与外泌体的生物学活性高度相关,肝素可有效抑制HSPGs摄取外泌体,从而抑制肿瘤发展。

    有研究显示,向小鼠体内植入异种移植物肿瘤,OSCC细胞来源的外泌体可以促进肿瘤的生长,而应用肝素抑制了肿瘤对外泌体的摄取,减弱了肿瘤的生长速率,因此,OSCC细胞衍生的外泌体可能是一种新的肿瘤治疗靶点。

    3.牙周致病菌来源外泌体

    除了细胞来源的外泌体,细菌也可以分泌外泌体,称为外膜囊泡(OMV)。细菌可通过释放OMV来增强毒力。通过OMV,细菌不需要和靶哺乳动物细胞接触即可将宿主细胞暴露于相对高浓度的毒素和额外的毒力因子中,这为细菌侵入宿主造成的免疫反应研究提供了新的方向。用牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌来源的OMV刺激牙龈成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞,OMV以剂量依赖的方式显著抑制培养的牙龈成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞的增殖,OMV还抑制人脐静脉内皮细胞毛细血管的形成,提示OMV可通过抑制牙周组织中的细胞增殖和血管再生促进慢性牙周炎。

    在慢性牙周炎中,OMV可能是局部和全身炎症刺激的重要来源,其通过将生物活性毒素和额外的毒力因子递送到牙周组织的易感细胞中而在牙周病中起作用。在具体的影响机制方面,有两方面的报道。其一,A型伴放线聚集杆菌分泌的OMV可以将多种蛋白质传送至HeLa细胞和人牙龈成纤维细胞,OMV可以被内化到HeLa细胞和人牙龈成纤维细胞的核周区域,共定位分析显示,内化的OMV与内质网共定位并携带抗原。

    伴放线聚集杆菌OMV的脂质成分主要是脂多糖,宿主通过内化OMV,在细胞内部暴露于来自完整囊泡或破裂囊泡的肽聚糖或者脂多糖片段中。来自霍乱弧菌、幽门螺旋杆菌、铜绿假单胞菌和淋病奈瑟球菌的囊泡被证明将肽聚糖或者脂多糖递送至宿主细胞,可以激活核苷酸结合寡聚化结构域蛋白质1(NOD1)和NOD2,NOD1和NOD2是NOD样受体(NLR)家族成员。NOD1和NOD2被证明是哺乳动物先天免疫中细菌感染的关键细胞内传感器,通过激活核因子NF-κB诱导免疫应答和消除细菌,并产生嗜中性粒细胞募集。

    NOD1和NOD2在各种细胞类型的口腔组织(例如上皮细胞、牙龈成纤维细胞和牙周韧带细胞)中功能性表达。已经发现A型伴放线聚集杆菌的OMV在人类胚胎肾细胞中可作为NOD1-和NOD2-依赖性NF-κB活化的强诱导剂,因此,A型伴放线聚集杆菌的OMV可以内化到人类细胞中,并传递部分激活NOD1和NOD2的抗原,有助于细菌外囊泡诱导的整体炎症反应。其二,miRNA是真核生物基因表达的主要调节者,但关于和miRNA相似大小的细菌miRNA(msRNA)研究很少。msRNA约为15~20个核苷酸的长度,有研究从牙龈卟啉单胞菌、伴放线聚集杆菌、齿垢密螺旋体中分离了msRNA,而且发现OMV分泌了这些msRNA,细菌的RNA可通过OMV被传递到真核生物。

    实验发现,外源性msRNA可抑制JurkatT细胞中某些细胞因子的表达,提示msRNA可能作为新型细菌信号分子介导细菌与人相互作用,为牙周致病机制提供新的见解。OMV也被用作疫苗的研究,牙龈卟啉单胞菌来源的OMV可作为牙周疫苗的免疫抗原。OMV被证明有蛋白酶抗性,能够经受长期的存储,其结构稳定性有利于携带内容物进入宿主免疫系统。通过鼻内接种疫苗的方法向小鼠体内接种OMV,可以在小鼠血液和唾液中产生牙龈卟啉单胞菌特异性的抗体,而且通过添加TLR3激动剂Poly(I∶C)这种反应显著增强。

    OMV和Poly(I∶C)共同刺激的小鼠血清不仅对疫苗株牙龈卟啉单胞菌(ATCC33277)而且对异种株牙龈卟啉单胞菌(W83和W50)的牙龈卟啉蛋白水解活性显示出抑制作用。经OMV和Poly(I∶C)小鼠免疫血清预培养后,牙龈卟啉单胞菌的活力下降,而这种血清热灭活后其杀伤作用被部分阻断。用OMV和Poly(I∶C)免疫的小鼠唾液样品增强了疫苗株和异种株的细菌凝集。在口腔感染的小鼠模型中,与仅Poly(I∶C)免疫的小鼠相比,用OMV和Poly(I:C)免疫的小鼠口腔中牙龈卟啉单胞菌的数目显著减少。在用OMV和Poly(I∶C)鼻内免疫的小鼠中引起高水平的血清IgG(包括IgG1和IgG2a)和唾液S-IgA,免疫后分别维持至少28周和18周。

    在近端器官鼻内免疫接种和脑内注射实验中检查OMV的积累证实了OMV的安全性。提示在牙周细菌清除方面,使用OMV和Poly(I∶C)进行鼻内免疫是一种可行且安全的疫苗策略。

    4.总结和展望

    口腔领域对外泌体的研究主要集中在外泌体介导细胞间通讯和调节免疫活性方面。唾液来源外泌体中含有唾液中的蛋白质和miRNA,而唾液外泌体稳定存在的特点,使得唾液外泌体能够成为理想的疾病监测标记物,唾液外泌体的具体形态是OSCC早期监测的一个新方向;而且,不论是唾液外泌体还是OSCC细胞来源的外泌体在肿瘤发展过程中都起了作用,同时也可以是疾病治疗的潜在靶点。牙周致病菌来源的外泌体是牙周免疫的一个新方向,也可以被用作牙周疫苗的开发。外泌体研究在口腔领域是一个新的方向,为口腔疾病的治疗和诊断提供了新的思路,同时也需要更多更深入的研究,以期未来能够造福于临床。

编辑: 陆美凤

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