正畸力下牙周膜干细胞的改变及其作用机制的研究进展

    牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）是从牙周膜中分离获得的一类具有自我更新能力、增殖能力、多向分化潜能和免疫调节能力的干细胞，是牙周组织的维持、改建及再生的重要细胞源。
    正畸牙移动（orthodontic tooth movement，OTM）是指在正畸力作用下，牙周组织发生适应性改建，进而产生牙齿移动的过程。OTM的过程中同时伴随有成骨、破骨两种活动，二者共同调控着牙周组织的改变，而PDLSCs作为牙周组织中的主要干细胞，在这一过程中发挥主要作用。正畸力通过细胞骨架将力传导给PDLSCs，从而激活胞内众多信号分子，使细胞发生在形态结构及功能上发生变化。
    因此，了解正畸力在OTM过程中对PDLSCs的作用及内在机制，对揭示PDLSCs在正畸牙周改建原理、探求正畸治疗中的适宜矫治力和诊治周期等方面具有重要意义。故本文对正畸力作用下PDLSCs的形态功能变化及其分子作用机制的研究进展做一综述。
    1.PDLSCs的基本特性
    1）分布与获取：
    PDLSCs是从牙周膜组织中分离出来的一种成体干细胞。2004年，Seo等首次自人第三磨牙中分离获得PDLSCs，并发现其具有多向分化的潜能，可在特定的培养条件下分化为成牙本质细胞、成骨细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、神经细胞等。Wang等的研究发现，牙周膜中的PDLSCs分布呈现出不对称性，近牙槽窝侧的细胞较近牙根侧的数量更多、增殖及多向分化能力更强。
    目前研究中使用的PDLSCs大多来自于正畸牙或阻生牙根中1/3的牙周膜组织。常见的PDLSCs分离方法有组织块生长法、酶消化法及二者结合法。上述方法在细胞培育成功率和细胞生物学特性表达上均具有一定的优缺点。刘娟等认为组织块生长法具有较高的细胞培养成功率，获得的细胞具备成纤维样细胞特性。但酶消化法可获得增殖潜能较强、更具备间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）特性的PDLSCs。因此有必要根据具体实验需要选择相应的分离方法。
    2）形态与表面标志物：
    PDLSCs形态上与成纤维细胞类似，呈长梭形，细胞多呈无序排列。乳牙源性的PDLSCs与恒牙源性的形态相似，也呈现长梭形，但体积相对较小。
    PDLSCs来源于中胚层，高表达MSCs特异性的表面标志STRO-1、CD146、CD29、CD44、CD106、CD13、CD59和CD90等。同时，PDLSCs还表达碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Ⅰ型胶原（collagen typeⅠ，COLⅠ）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein，BSP）、骨钙素（osteocalcin，OCN）、转化生长因子-β受体（transforming growth factor-β receptor，TGF-βR）等成骨相关的表面分子标记物。
    3）基本生物学功能：
    ①增殖能力：作为来源于牙周膜组织的成体干细胞，PDLSCs具有高度自我更新和增殖能力。在与骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）和牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）进行细胞增殖速率的比较时，发现PDLSCs具有更强的增殖能力。
    ②多向分化能力：PDLSCs具有多向分化潜能，可在特定的体内、外诱导条件下，分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等。Seo等的研究表明PDLSCs可高表达成骨相关基因，具有分化为成骨细胞样细胞的潜力，并可形成矿化结节。他们还发现了PDLSCs可向脂肪干细胞分化，并且在这类细胞的胞质中含有脂滴和高表达的脂肪相关标记基因。
    Xu等人成功将PDLSCs诱导分化为软骨细胞样细胞、成骨细胞样细胞和脂肪细胞样细胞。另外，Pelaez等发现，PDLSCs在短期机械力刺激下，可分化为心肌样细胞，并表达心肌细胞相关的标志蛋白。Kadar等也发现，PDLSCs既可以分化为MSCs系，也可分化为内胚层及外胚层细胞系。在众多分化能力中，PDLSCs的骨向分化的能力尤其被关注，这使得PDLSCs在OTM及牙周组织再生领域研究中都有着重要意义。
    ③免疫调节能力：MSCs普遍具有相似的免疫调节能力。PDLSCs作为其中的一员，由于缺乏HLA-II DR或T细胞共刺激分子（CD80和CD86）而具有低免疫原性。这使得PDLSCs的免疫调节效应是没有抗原特异性和选择性的，因此，异体PDLSCs移植几乎不引起宿主的免疫反应，这使其成为干细胞移植的优质细胞源。
    同时，PDLSCs对各种免疫细胞，如T细胞、B细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞等，也具有一定的免疫调节作用。Wada等发现，在与单核细胞的共培养实验中，PDLSCs通过分泌TGF-β1、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）和吲哚胺2，3-双加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）等可溶性免疫因子，抑制外周血单核细胞增殖，减少干细胞移植时免疫反应的产生率。PDLSCs的免疫调节能力也可体现在调控免疫细胞的亚群分化。
    例如，PDLSCs可以诱导T细胞向调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）分化，抑制其向辅助性T细胞17（（T helper cell 17，Th17）亚群分化，且这一调节能力在牙周组织处于炎症状态时减弱，可见PDLSCs参与了调节部分免疫细胞的增殖和分化。
    2.正畸力作用下PDLSCs的形态结构变化
    1）细胞形态及排列方式变化
    Wang等发现，在静态牵张力作用下，PDLSCs由不加力时的长梭形形态变得更加细长，同时细胞也从原先的漩涡状、放射状随机排列逐渐趋向平行排列并与牵张力加载方向垂直。同时，细胞骨架纤维的排列方向也同样从无序转为平行且与加载力方向垂直。
    赵艳等发现，在正畸牵张力加载期间，PDLSCs的Rho关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶1（Rho associated coiled-coil containing protein kinase 1，ROCK1）、Ras同源基因家族成员A （Ras homolog gene family member A，RhoA）和磷酸化丝切蛋白（p-cofilin）等细胞骨架相关蛋白的表达水平也有所上调。并且PDLSCs的形态、排列方式及细胞骨架的改变与施加力的强度和作用时间具有显著相关性。随着牵张力的增大，细胞的有序性平行排列现象和细胞骨架蛋白表达水平均呈现先增强后逐渐减弱的特点。
    2）胞内信号分子及细胞器变化
    Yoo等从经过正畸治疗1月后的牙齿的牙周组织中分离培养了PDLSCs，发现其成骨相关标志物ALP、Runt相关转录因子2 （runt-related transcription factor 2，Runx2）、OCN和OPN的表达水平均较未经正畸治疗组显著上调。这提示我们，临床正畸过程中，正畸力（牵张力和压应力）可通过影响胞内成骨相关蛋白的含量，改变矿物质沉积过程，影响硬组织的形成，进而调控骨改建。
    还有研究关注到，PDLSCs在牵张力作用下，细胞中对氧气感知的关键分子乏氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的表达量随加力时间延长而不断增高。同时，在细胞内可观察到线粒体肿胀、空泡样改变、褶皱和嵴的消失以及内质网线粒体耦联程度增加等形态学变化。这一发现表明，细胞缺氧时，细胞器的形态变化及细胞器之间的相互作用可参与调控正畸成骨分化活动，这为正畸牙张力侧成骨分化增强的机制提供了新的见解。
    3）周围组织改变及细胞浸润情况：
    正畸治疗中所产生的应力会导致PDLSCs的胞内外物质产生动态性的变化，牙周组织发生改建，最终产生牙齿移动。
    在正畸加力过程中，压力侧的牙周膜间隙会变窄，牙周组织内的毛细血管腔因压迫缩窄，组织处于缺氧状态，破骨细胞被刺激生成。而在张力侧，适度的牵张力可使PDLSCs的成骨分化和增殖能力增强。因此，在正畸过程中，压力侧破骨细胞作用占主体，表现为骨吸收；在张力侧，则反之，骨形成占优势。同时，应力作用下，牙周组织会局部缺氧，组织内的血运改变，细胞因子、集落刺激因子、神经递质、花生四烯酸等代谢物质在刺激下产生，进而引发一系列的无菌性炎症反应。
    4）细胞功能变化：
    ①增殖能力：OTM过程中可能会发生细胞凋亡。体外加压处理后的PDLSCs增殖能力下降，且细胞内凋亡蛋白Caspase-6及Caspase-9的表达上调，PI3K/AKT通路表达增强。
    ②成骨分化能力：目前普遍认为，PDLSCs的成骨分化能力可在适宜的牵张力作用下得以促进。Liu等发现在循环张力刺激后，PDLSCs中成骨标志物ALP、Runx2和OCN的表达量显著上调，并具有时间依赖性。而压应力对PDLSCs成骨分化能力的调节也表现出两重性：一定力值和作用时间的压应力可促进PDLSCs成骨，而当力值或作用时间超出这一范围后，则主要表现为破骨活动。
    另外，机械振动也会影响PDLSCs的成骨分化过程，且振动频率和强度是重要影响因素。Zhang等在实验中发现，加速度为0.05 g～1.0 g（g=9.81 m/s2）、频率为50 Hz的机械振动可以促进PDLSCs表达成骨相关标志物ALP、OCN、COLⅠ和Runx2，并且在加速度为0.3 g时成骨作用最强。
    ③免疫调节能力：OTM是一个无菌性炎症反应的过程。机械力可以激活PDLSCs的免疫活性，促使其发挥免疫调控作用。目前已发现PDLSCs可能在机械刺激下介导炎症过程并促进破骨细胞生成。体外实验证明，机械负荷（包括张力、压缩和振动）诱导PDLSCs表达高水平的促炎细胞因子、趋化因子、β-2肾上腺素能受体和H2S。
    同时，在正畸力作用下，压力侧牙周组织被压缩，导致部分PDLSCs发生凋亡，并诱导多种细胞因子的合成和分泌，募集T细胞、B细胞以及巨噬细胞迁移至炎症区域。局部产生的肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）对于T细胞的活化具有重要作用。激活的T细胞可以促进核因子κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）的表达，影响破骨细胞分化。
    3.正畸中调控PDLSCs形态功能变化的信号通路及分子
    不同正畸力（牵张力与压应力）作用于PDLSCs会使细胞形态与功能发生相应改变，这与机械力介导的细胞骨架重组密切相关。脂质力原理（force-from-lipid，FFL）认为机械力可通过膜张力直接传递至离子通道，细胞通过细胞骨架和表面受体连在一起，把胞内器官与细胞外基质偶联，细胞骨架通过肌动蛋白肌球蛋白丝的滑动机制感知外部作用力进而调整细胞形态，但细胞如何将当正畸力信号翻译成不同的细胞反应的机制仍不明确。目前已发现正畸力可以介导以下胞内信号通路：
    1）Wnt/β-catenin信号通路：
    Wnt/β-catenin通路在细胞成骨及成脂分化中发挥重要作用。经典Wnt通路通过调节成骨细胞和破骨细胞活性之间的平衡来维持骨稳态，参与机械转导，具有将细胞外机械信号转化为细胞内生物信号的能力。Zhang等的研究表明，经典Wnt通路可通过其下游靶点介导PDLSCs中的液压信号转导，并通过平衡RANKL/OPG的表达参与体外破骨细胞形成。Lu等发现，当一定强度和时间的静压力作用于PDLSCs时，细胞中的Wnt/β-catenin信号通路会被激活，并可抑制细胞成骨相关标志物ALP和Runx2的表达。这提示在正畸牙齿移动过程中，经典Wnt信号通路可抑制PDLSCs成骨的能力。
    2）PI3K/AKT信号通路：
    PI3K信号转导和下游分子Akt蛋白激酶参与成骨细胞增殖、骨骼发育和干细胞成骨分化。孟庆芳等模拟正畸静压力刺激对PDLSCs作用的研究发现，细胞增殖被明显抑制。在此过程中，PI3K/AKT信号通路较对照组明显增强，其下游的Caspase蛋白家族中的Caspase-6和Caspase-9表达显著上调。这说明，在正畸过程中，压力侧的PDLSCs极有可能通过PI3K/AKT信号通路诱导细胞内凋亡蛋白过表达，从而抑制细胞增殖，达到调控骨吸收的作用。
    3）TGF-β/STAT信号通路：
    TGF-β在包括牙周膜组织在内的多种组织的免疫调节、发育、增殖、成骨细胞分化、伤口愈合和再生中发挥重要作用。应力刺激下，TGF-β可能通过激活下游的Akt磷酸化信号通路，调控牙周膜改建。且周巳入等发现，正畸张力侧STAT3的表达改变可能与正畸牙移动的骨改建相关。但是，TGF-β/STAT信号通路在OTM中的具体作用仍不明确，有待进一步研究。
    4）Notch1信号通路：
    Notch信号通路参与细胞增殖和分化过程，可通过相邻细胞间的相互作用进而调控与增殖和分化相关的基因表达，在骨形成和骨改建中发挥了重要作用。
    邱申彩等发现Notch1的过表达载体可以促进人PDLSCs的分化和增殖。王林等也经实验探究发现，张力作用下，Piezo1蛋白表达增多，Notch1通路被激活，ALP、Runx2、OCN和BSP表达量上调，成骨活动增强。
    由此可见，正畸骨改建是由包括上述信号通路在内的多个调控机制相互作用完成。而在此过程中，ALP、Runx2等成骨相关因子发挥着重要作用，并且它们的表达受到许多信号传导途径如Wnt、BMP和Notch等的调控。这些信号通路可借由ALP、Runx2等彼此交联，共同参与调节PDLSCs的增殖、迁移、多向分化能力及免疫调节能力，进而实现牙槽骨及牙骨质的改建及再生，达到牙齿移动的效果。
    4.小结
    PDLSCs来自间充质组织，具有高度自我更新、多向分化潜能，在维持牙周组织动态平衡及牙周组织再生中起着重要的作用。在正畸力作用下，PDLSCs的细胞形态及胞内成骨相关物质的表达量上调，并伴随增殖、凋亡和免疫反应等一系列细胞活动，且这些改变均与正畸力的类型、强度及作用时间密切相关。在此过程中，Wnt/β-catenin、PI3K/AKT、TGF-β/STAT及Notch1等信号通路借由TGF-β1、Runx2、BMP-9等上下游分子彼此交联，实现正畸骨改建和牙移动。
    OTM是由正畸力介导的一系列牙周改建过程，研究机械力刺激下的PDLSCs变化可帮助我们加深对正畸临床中牙周组织重建规律的理解，有助于加快正畸进程，避免正畸过程中的牙根吸收和牙周炎症的产生，减轻患者不必要的痛苦，推动临床中更加安全高效的完成正畸治疗。