噬菌体疗法应用于牙周炎的研究进展

    牙周炎是发生于牙齿支持组织，由菌斑生物膜引起的慢性感染性炎症性疾病，是口腔最常见的疾病之一。主要以牙周附着丧失、牙槽骨吸收、牙齿松动及脱落为临床症状，是成人牙齿脱落的主要原因。牙周炎的基础治疗方法是用机械的手段清除牙齿周围的牙石、菌斑从而控制炎症，常常辅以局部或全身用药，但牙周致病菌的频繁定植和口腔耐药菌的出现对常规牙周炎的治疗方法提出了挑战。
    噬菌体是感染细菌的病毒，具有较强的专一性和破坏生物膜的能力。噬菌体疗法就是利用噬菌体的宿主专一性感染或裂解细菌从而治疗细菌感染的一种治疗方法。近年来随着抗生素耐药性的不断增强及超级细菌的出现，噬菌体疗法重新成为研究热点，并且成功用于治疗多种细菌感染性疾病。噬菌体疗法虽然在口腔领域中尚未得到广泛应用，但已有大量实验分离出与牙周致病菌相关的噬菌体用于牙周炎的治疗，为牙周炎的新疗法提供临床思路。
    1.噬菌体及其分类
    噬菌体是一种感染细菌的病毒，其必须在活菌内寄生，利用细菌的核糖体、蛋白质合成自身所需的各种因子、氨基酸和能量来实现生长和繁殖，具有严格的宿主特异性。
    大部分噬菌体属于有尾噬菌体目（Caudovirales），根据其尾巴的长度及复杂性可分为3个科：长尾噬菌体科（Siphoviridae，长而非收缩的尾部，通常是溶原性噬菌体）；肌尾噬菌体科（Myoviridae，长而易收缩的尾部，通常是裂解性噬菌体）和短尾噬菌体科（Podoviridae，短而非收缩性的尾部，通常是裂解性噬菌体）；根据其对宿主细菌的寄生方式可分为：裂解性噬菌体和溶原性噬菌体。
   裂解性噬菌体（又称为毒性噬菌体）的特点是其裂解生命周期，噬菌体吸附在细菌表面的受体上，注入并复制它们的DNA，导致宿主细胞裂解，随后释放子代噬菌体感染其他细菌，完成一个裂解循环；溶原性噬菌体（又称为温和噬菌体）一般不使细菌裂解，而将其基因组整合到细菌染色体中以稳定的形式（即前噬菌体）在宿主内共存，不产生子代噬菌体，随细菌的分裂而传代。有时因环境因素的改变也可以脱离宿主DNA进入裂解周期，产生子代噬菌体最终裂解细菌。
    在噬菌体治疗中溶原性噬菌体很少使用，因为其不能100%杀死受感染的细菌，而且可以通过溶原性转换参与水平基因转移和重组，可能会增加细菌的致病潜力，产生更多的致病菌。
    2.噬菌体疗法的研究进展
    噬菌体疗法是通过噬菌体的宿主专一性来感染细菌，裂解细菌或降低细菌致病性，从而治疗细菌感染的一种治疗方法。D’Herelle在20世纪初提出使用噬菌体治疗人类和动物的细菌感染，并且第1次尝试应用噬菌体制剂成功治疗4例细菌性痢疾患儿。由此，欧洲及美洲多名学者将其应用于细菌性痢疾、葡萄球菌引起的皮肤感染以及霍乱等治疗。然而，这种方法在西方并没有被广泛接受，20世纪40年代抗生素出现后，噬菌体研究转向了更基础的水平，大部分欧美国家基本放弃对噬菌体的研究。近年来随着抗生素耐药性的不断增强，噬菌体疗法重新引起了西方国家研究者们的关注。
    大量体外和动物实验表明，噬菌体疗法在治疗皮肤及软组织感染、呼吸道感染、胃肠道感染、泌尿道感染、眼部、耳部、口腔内的感染、菌血症等具有很大潜力。除此之外，噬菌体疗法已成功治疗多种人类疾病。Kuipers等运用噬菌体成功治疗1例肾脏移植患者慢性复发性尿路感染；Maddocks等将噬菌体AB-PA01与抗生素联合使用治疗铜绿假单胞菌引起的肺炎和脓胸。
    Ramirez-Sanchez等用噬菌体鸡尾酒AB-SA01静脉及关节腔内注射，成功治疗金黄色葡萄球菌引起的假体感染。有学者以鲍曼不动杆菌噬菌体加铜绿假单胞菌噬菌体鸡尾酒疗法成功治疗了1例CRAB和CRPA肺部感染的高龄患者，在治疗过程中肾功能正常，心肌酶正常，监测血内毒素无明显升高，具有良好的安全性，提示噬菌体治疗耐药细菌的巨大医疗前景。
    3.噬菌体疗法的安全性研究
    虽然有学者认为噬菌体对人体、人体菌群、免疫系统可能存在一定的影响，以及细菌裂解引发内毒素释放等潜在的安全性问题，但是大部分动物及临床实验证明噬菌体疗法是安全的。
    3.1 动物实验
    Dufour等通过鼻内灌注两株大肠杆菌536和LM33建立小鼠急性肺炎模型，鼻内注射两株噬菌体536_P1和LM33_P1，并与腹腔注射抗生素作比较，测定全血计数、肺水肿、细胞因子水平等，结果表明噬菌体能更快地杀灭细菌和纠正血细胞计数异常，以特异性的方式调节免疫反应且没有任何不良的临床观察结果。
    Drilling等进行了1项长期噬菌体安全性研究，在金黄色葡萄球菌感染的绵羊鼻窦炎模型中，运用噬菌体鸡尾酒NOV012（P68和K710）局部冲洗鼻腔，2次/d，持续20 d，期间未观察到鼻窦黏膜内的炎症浸润或组织损伤等，证明噬菌体鸡尾酒NOV012可以安全地长时间应用于绵羊鼻窦炎，表明噬菌体疗法在治疗慢性细菌性鼻窦炎方面具有很大潜力。
    Fong等经过7 d的生物膜形成期，绵羊进行每日2次的CT-PA鼻腔冲洗，持续3周，治疗期间收集血液和粪便样本，对鼻窦、肺、心、肝、脾、肾组织进行组织病理学检查，结果表明CT-PA在一定浓度下可减少铜绿假单胞菌生物膜，且器官组织无治疗相关的损伤，未见明显的安全性问题。
    3.2 临床试验
    2005年第1项关于噬菌体疗法安全性临床试验，Bruttin等在15名健康志愿者的饮用水中加入较高的大肠杆菌噬菌体T4剂量（剂量A，105 PFU/mL），较低的大肠杆菌噬菌体T4剂量（剂量B，103 PFU/mL）和安慰剂（剂量C），研究前后未观察到共生大肠杆菌种群的大量噬菌体T4复制和T4特异性抗体，血清转氨酶水平正常，未发现安全性问题。
    Febvre等进行了1项双盲、安慰剂对照实验，研究大肠杆菌靶向噬菌体的商业鸡尾酒对健康人群肠道微生物群以及肠道和全身性炎症标志物的影响，健康的成年人摄入该噬菌体鸡尾酒28 d并收集粪便和血液样本，随着噬菌体的消耗观察到粪便大肠杆菌负荷减少，然而α和β多样性参数无显著变化，短链脂肪酸的产生、炎症标志物和脂质代谢基本无改变，证明了噬菌体具有在不破坏肠道群落的情况下选择性地减少目标生物体的潜力。
   McCallin等在金黄色葡萄球菌携带者中比较了鼻腔和口腔分别接触单种噬菌体、噬菌体鸡尾酒Eliava Pypophage和安慰剂的影响，试验期间通过监测体温、血常规、肝功能、肾功能等，均未发现任何异常，支持了金黄色葡萄球菌噬菌体作为单个噬菌体或噬菌体鸡尾酒的临床安全性。
    4.噬菌体疗法在牙周炎治疗中的应用
    1999年Socransky等总结出与牙周炎密切相关的主要为红、橙、黄、绿、紫、蓝6种微生物复合体：包括牙龈卟啉单胞菌、福赛坦氏菌、齿垢密螺旋体、具核梭杆菌、中间普氏菌、变黑普氏菌、微小消化链球菌、链球菌、伴放线放线杆菌等。牙周疾病发生后，噬菌体在牙周微生态平衡的恢复中发挥着重要作用。当前噬菌体疗法相关制剂的主要研发方向为传统的活噬菌体制剂、噬菌体裂解酶制剂和基因工程噬菌体3个方面。
    4.1 传统的活噬菌体制剂治疗牙周炎
    传统的活噬菌体疗法是指将天然分离的毒性噬菌体作为新的抗菌剂直接用于抗菌治疗，从而裂解杀灭感染病灶中的致病菌。噬菌体在牙周炎治疗方面已有报道，Dalmasso等从人类唾液样本中分离出1种新的噬菌体φAPCM01，有效抑制链球菌生物膜的形成。Castillo-Ruiz等从牙科废水中分离出与侵袭性牙周炎密切相关的伴放线放线杆菌的噬菌体Aabφ01用于侵袭性牙周炎的治疗。
    Machuca等和Kabwe等分别提取出牙周病原菌具核梭杆菌的噬菌体Fnpφ02和FNU1，可显著抑制具核梭杆菌生物膜的形成从而抑制牙周炎。Mitchell等分离出齿状密螺旋体的噬菌体颗粒φtd1用于慢性牙周炎的治疗。粪肠球菌是难治性根尖周炎及根管治疗失败后的主要细菌，以生物膜的形式存在且极难根除，相关研究表明牙周炎患者龈下菌斑生物膜中粪肠球菌的检出率较健康牙周者显著升高，粪肠球菌可促进牙周炎的发生发展。Bhardwaj等从污水样品中分离出粪肠球菌噬菌体，可抑制牙周炎患者粪肠球菌生物膜的生成。
    4.2 噬菌体裂解酶制剂治疗牙周炎
    噬菌体裂解酶又称内溶素，是一类细胞壁水解酶，通过消化细菌细胞壁中的肽聚糖从而释放组装好的噬菌体颗粒裂解细菌，可以解决传统活噬菌体存在宿主范围窄、噬菌体抗性等缺陷。目前用于牙周炎的报道较少，但已有一些研究证明噬菌体裂解酶对于控制口腔疾病起重要作用。徐晶晶等通过实验表明噬菌体裂解酶ClyR对变异链球菌和远缘链球菌有快速显著的杀菌作用。van der Ploeg通过测定噬菌体裂解酶M102的基因组序列，确定它是第1个以变形链球菌为宿主的噬菌体，可作为预防及治疗龋齿的抗菌剂。
    4.3 基因工程噬菌体治疗牙周炎
    基因工程噬菌体是利用基因工程修饰噬菌体，优化噬菌体的治疗潜力，包括增强噬菌体裂解能力、扩大宿主范围、减少噬菌体抗性等，使其能较精确地检测和控制细菌。Tinoco等使用基因工程噬菌体φEf11/φFL1C（Δ36）PnisA处理粪肠球菌感染的牙本质，耐药菌株明显减少。Guo等发现基因工程改造的噬菌体能有效抑制变异链球菌的生长。Smith成功地将抗体抗原结合位点的遗传信息插入噬菌体DNA中，筛选出能与抗体特异性高度结合的噬菌体，为单抗药物的开发提供了新的启发。
    5.总结与展望
    应用噬菌体疗法治疗牙周炎具有良好的前景，与抗生素相比噬菌体疗法的优势主要表现在：①感染具有高度特异性，对共生菌群的伤害较小；②噬菌体存在于宿主时表现出快速的自我繁殖能力，较少剂量足以控制致病菌的感染；③抗生素和噬菌体之间不存在交叉耐药，使噬菌体成为治疗耐药细菌有前景的解决方案；④破坏细菌生物膜的效率更高；⑤易于分离，有细菌存在的地方就能找到相应的噬菌体；⑥由于宿主裂解后产生大量噬菌体后代，因此产生毒性噬菌体的成本较低。
    然而噬菌体疗法也存在一些不足：①噬菌体在侵染细菌的同时，也会增加细菌的耐受能力，产生噬菌体抗性抵抗噬菌体感染，然而目前研究认为噬菌体内溶素可以很好地解决细菌产生抗性的问题；②噬菌体裂解细菌过程中会产生内毒素，可能会诱导人体的免疫反应从而带来严重的副作用；③由于噬菌体的高特异性需要正确识别目标细菌，选择合适的噬菌体进行治疗，当宿主细菌难以培养时，噬菌体的分离培养就变得更加困难。
    噬菌体疗法不但可以解决抗生素耐药性问题，对于一些难治性牙周炎也具有较好的潜力。但是有关研究表明噬菌体对牙周炎的发生发展也发挥了重要作用，因此口腔噬菌体作用于牙周致病菌的潜在机制尚未完全明了，两者之间的平衡点需进一步研究，例如噬菌体给药方式、给药频率、治疗持续时间、噬菌体抗性的出现等。口腔噬菌体丰富且高度多样，但迄今为止只对少数噬菌体分离株进行了彻底的研究，需要更多噬菌体的分离鉴定以用于预防和治疗牙周炎。