【摘 要】 目的：通过热休克预处理提高人牙髓细 胞HSP70的表达水平，建立供体外实验研究的热 休克细胞模型。方法：将体外培养的人牙髓细胞爬片后进行热处理 ，置42℃水浴25min，37 ℃复温。于复温后1、2、3、4、6、8、10h、1d固定，进行HSP70的免疫组化染色； 9 6孔板细胞同样方法热处理，连续培养3d后，进行MTT检测。结果： 正常对照牙髓细胞呈阴性表达。热休克处理牙髓细胞1、2h组中度阳性着色，3、4h组强 阳性着色，6、8、10h组达到高峰，1d组恢复到弱阳性水平。MTT检测显示热处理组与对照 组无统计学差异。结论：热预处理方法可成功诱导人牙髓细胞表达H SP70；该方法不会导致连续培养3d后细胞存活数量的明显变化。
【关键词】 热休克蛋白； 人牙髓细胞； 细胞培养
热休克蛋白在应激状态下，能够稳定细胞肽链，保护核内重要遗传物质， 减轻细胞损伤 并加速损伤修复，对于维持细胞生存和行使正常功能具有重要意义［1］。为了深入 研究热休克蛋白在牙髓细胞中的生物学作用，本实验旨在通过热休克预处理提高人牙髓细胞 热休克蛋白(HSP70)的表达水平，建立人牙髓细胞热休克模型。
1 材料和方法
1.1 材料和仪器
DMEM培养液(gibco，USA)、胎牛血清FCS（ 浙江金华清湖犊牛利用研究所）、HSP70抗体（ SPA-810，Stressgen公司,Canada）、SABC试剂盒（宝泰克）、MTT（ Sigma，USA）、DMSO （西安化学试剂厂）、96孔培养板、24孔培养板、分光光度计（华东电子管厂）。
1.2 人牙髓细胞的培养
取因阻生或正畸拔除的健康牙齿，用无血清DMEM培养液冲洗后，劈冠取出牙髓组织，在 DMEM浸润下，剪切成1mm3大小碎块，均匀铺于25ml培养瓶底，将瓶底翻转向上，加入含150ml/L FCS的DMEM培养液4ml，置CO2孵箱37℃孵育，2h后将瓶底翻转向下，每3天换液1 次，至细胞从组织块中游出，取第3代进行实验。
1.3 热休克预处理及免疫组化染色
取生长良好的第3代牙髓细胞，以浓度2×107/L接种于置有盖玻片的24孔板2张，每3天换 液1次，待细胞爬满玻片生长为单层，随机取出4张附有细胞的玻片作为正常对照组，0.01mo l /L PBS漂洗3遍，40g/L多聚甲醛4℃固定过夜，SABC免疫组化法进行诱导型HSP70的染色；其 余玻片连同培养板置入水浴箱进行热休克处理——42℃孵育25min，再于CO2孵箱37℃复温 。分别于复温后1、2、3、4、6、8、10h、1d随机抽取各4张玻片固定染色（方法同上 ），脱水透明封片，光镜观察，HE染色对照。
1.4 MTT检测
取生长良好的第3代牙髓细胞，以浓度2×107/L接种96孔板2张，每张36孔。待细胞贴 壁后，热休克处理，37℃复温2h。连续培养3d，490nm下进行MTT检测（重复3次实验），统 计学处理。
2 结果
2.1 HE染色
HE染色显示，牙髓细胞形态完整，在40倍光镜下随机选择10个视野进行统计比较，正常对照 组死亡细胞百分比为2.73±0.30，热休克处理组为2.65±0.26，二者无统计学差异(P>0 .05)。
2.2 免疫组化染色
正常对照组：牙髓细胞胞浆淡黄色着色，胞核淡黄着色（图1）。
热休克处理组：牙髓细胞胞浆淡黄色至棕黄色着色，胞核呈深棕黄颗粒着色。1h组和2h组（ 图2）中度阳性着色，3h组（图3）和4h组强阳性着色，6h组、8h组和10h组达到高峰，1d 组恢复到正常对照水平（图4）。
2.3 MTT检测
热休克处理组A值为0.451±0.041，正常对照组A值为0.432±0.022，重复测3次， 二者无统计学差异(P>0.05)。
图1 免疫组化染色，正常对照组 ×40
图2 免疫组化染色，1h和2h组 ×40
图3 免疫组化染色，3h和4h组 ×40
图4 免疫组化染色，1d组 ×40
