含镧羟基磷灰石的细胞毒性研究

　　【摘　要】　　目的：体外研究含镧羟基磷灰石的细胞 毒性。方法：选用建系的L929成纤维细胞和原代培养的SD大鼠头盖 骨细胞 进行实验；采用中性红测试法、MTT测试法及碱性磷酸酶（ALP）活性测试法研究含镧羟基磷 灰石浸提液对细胞活性、增殖及功能表达的影响。结果：中性红法、MTT法测试的活性细胞百分率（RGR）均高于75%； 不同浓度材料浸提液与成骨细胞作用后ALP活性的A值，与阴性对照组相比较各组间 无显著差异。结论：含镧羟基磷灰石无细胞毒性作用。
　　【关键词】 含镧羟基磷灰石；细胞毒性

　　目前用于人体硬组织（骨和牙）修复和替换的生物活性陶瓷材料主要 是羟基磷灰石。而在骨组织 中的磷酸钙种类很多，某些微量离子在骨组织形成过程中起着非常重要的作用。在骨骼中稀 土元素属微量离子，已有学者发现镧、铈等稀土元素在牙齿矿化方面起一定的作用［1 ，2］。 因此深入研究这些离子的生物学效应，有助于了解磷酸钙生物陶瓷材料的成骨机制，从而开 发出更加适合骨修复的磷酸钙类生物活性材料。本研究在合成含镧羟基磷灰石的基础上 ［3］对其细胞毒性进行检测，为进一步研究和应用此类材料提供生物学依据。

1　材料和方法

1．1　制备含镧羟基磷灰石

　　将合成的两种组分（1La-HA和10La-HA）含镧羟基磷灰石200目 过筛制粉，900℃烧结，　60Co照射灭菌备用［3］。

1．2　材料浸提液的制备

　　将两种粉按重量/浸提介质=1g/10ml, 用DMEM培养液在37℃浸提120h待用。

1．3　细胞培养

　　选用两种细胞，一是建系的L929成纤维细胞（第四军医大学口腔生物学教 研室提供）。另一种是原代培养的SD大鼠头盖骨细胞：取刚出生的SD大鼠6只，无菌环境中 取出头盖骨，无血清DMEM培养液洗3遍；去净骨缝及骨片表面的软组织，剪碎骨片；置入4m l 2.5g/L胰蛋白酶中37℃消化2h，弃去含消化细胞的上清液。用骨消化液（含10g/L Ⅰ型胶 原酶，2.5g/L胰蛋白酶）4ml 继续消化2遍，每次1h，收集含消化细胞上清。离心，弃上清 ，将 沉淀的细胞置培养瓶中，DMEM，37℃，50ml/L CO2环境中培养；收集第三代细胞进行实验 。将上述两种细胞按浓度2×107/L分别接种到96孔板中。每孔重复4遍。

1．4　浸提液作用培养细胞

　　将浸提液按100%、50%、10%、1%浓度稀释，阳性对照为6.4ml/L苯酚，阴性对照为细胞培养 液。细胞贴壁24h后，移去上清。取上述实验组分别加入100μl, 37℃，50ml/L CO2环境 中培养。

1．5　细胞活性检测——中性红法

　　细胞培养3d后，取浸提液与L929作用的培养板，移去上清，每孔加入100ml/L甲醛200μl， 继 续培养15min；移去上清，每孔加入100ml/L醋酸200μl，继续培养30min。酶联免疫仪上，4 90nm波长下测吸光值（A1），取平均值。

1．6　细胞代谢活性检测——MTT法

　　细胞培养3d后，取浸提液与L929作用的培养板，每孔加5g/L的MTT 20μl，37℃孵育4h 。弃上清，每孔加纯DMSO 150μl，震荡10min。酶联免疫仪上，490nm波长下测吸光值（A2），取平均值。

1．7　细胞分化功能检测——ALP活性

　　细胞培养5d后，取浸提液与成骨细胞作用的培养板，弃上清，0.01mol/L PBS(pH7.4)洗 各培养孔3次，加入3g/L triton-X100 100μl，4℃过夜，再加入150μl碱性磷酸酶底物液 ， 37℃孵育40 min ，加入50μl 的1mol/L NaOH终止反应，在酶联免疫仪上，410nm波长测吸 光收值（A3），取平均值。

2　结果　(表1、2)

表1　两种材料各浓度浸提液与细胞作用后的吸光值（±s）