摘要 目的:研究具核梭杆菌的内毒素（LPS）对重组人成骨蛋白-1（rhOP-1）诱导牙髓细胞增殖、分化的影响。方法:采用噻唑盐比色测定（MTT)、酶动力学方法和放射免疫技术。结果:在较低浓度LPS作用时，可协同增加rhOP-1对牙髓细胞增殖和碱性磷酸酶（ALPase）活性，但对骨钙素（BGP）无明显影响，而高浓度LPS则起抑制作用。结论:提示适度的LPS在牙髓对龋病的防御反应过程中起着一定调节作用。
关键词 脂多糖 重组人成骨蛋白-1 牙髓细胞 碱性磷酸酶
牙髓-牙本质复合体在龋病、磨耗、备洞等外界刺激下将产生不同程度的自身防御反应，如修复性牙本质或牙髓炎症,在牙本质受到损害时，成牙本质细胞形成一层修复性牙本质，不仅增加了牙本质的厚度，而且使成牙本质细胞退到牙髓腔中远离损害区的部位。尽管牙髓组织终身可形成继发性牙本质，但修复性牙本质形成所特有的部位和快速性引起了人们的关注。这种反应机制尚未完全清楚，但可以肯定，开放的牙本质小管将刺激信号传递给牙髓组织，其中的一些免疫细胞如Ia抗原表达细胞和巨噬细胞聚集在牙本质小管下层，触发了牙髓最初的防御反应［1］。龋洞中细菌有多种致病因素可激发宿主的免疫反应，其中G-菌的一种共同毒力因子即内毒素脂多糖（LPS），可刺激体内多种细胞产生生长因子。生长因子是胞外基质变化、细胞增殖、分化的影响因素，而各生长因子之间量的变化可能是影响其生物效应的关键。骨形成蛋白（BMPs）作为细胞外基质，在骨和牙齿的形成中有重要作用［2,3］。但不同剂量的LPS是否直接影响各生长因子之间量的变化，直接或间接调节BMPs的生物活性，尚是一个值得研究的问题。本实验观察了具核梭杆菌（Fn.）的LPS对BMPs一员，重组人成骨蛋白-1（rhOP-1，又名BMP-7），诱导体外培养人牙髓细胞的影响，为龋病中牙髓牙本质复合体的自身修复防御机制提供了一定理论依据。
1 材料和方法
1.1 实验材料
第5代人牙髓成纤维细胞,Fn．LPS和rhOP-1（由第四军医大学口腔医学院牙髓生物实验室提供),RPMI1640培养液（Gibco，美国），胎牛血清(FBS)(浙江金华清湖犊牛利用研究所)，噻唑蓝（MTT)(Sigma公司,美国),碱性磷酸酶（ALPase）试剂盒（BGH，生物化学公司,中国台湾),骨钙素（BGP）试剂盒（福瑞生物工程公司）。
1.2 实验分组
实验组分别为不同浓度的LPS(依次为0、100 ng/ml,1、10、100 μg/ml)和不同浓度的rhOP-1（依次为0、1、10、100 ng/ml,1、10 μg/ml)的不同组合。空白孔为RPMl1640液。每组复种4孔。
1.3 实验方法
1.3.1 MTT比色测定 取生长良好的第5代人牙髓成纤维细胞，调整牙髓细胞浓度为2×104/ml，接种于96孔板，每孔200 μl。标准环境下以10%FBS的RPMI 1640孵育24小时,弃去培养液和未贴壁的牙髓细胞，按实验分组加人用1％FBS的RPMI 1640配制的不同浓度rhOP-l和LPS的培养液。标准环境孵育5天，每孔加入20 μl MTT液，继续孵育4小时，弃去培养液，每孔加入150 μl的二甲亚枫（DMSO）,振荡10分，用酶联检测仪（华东电子管厂）在490 nm波长下测光密度值（OD），取4孔均值。
1.3.2 ALPase活性测定 细胞接种方法同上。标准环境孵育5天,弃去培养液，加入100 μl缓冲裂解液Tritron X-100，超声振荡15分,每孔加入100 μl标准底物液，37℃孵育30分,以0.l mmol/L NaOH终止反应，用酶联检测仪在410 nm波长处测OD值，取4孔均值。
1.3.3 BGP测定 取上述孵育5天后的培养液各25 μl，加入125I-BGP100 μl和抗血清100 μl，每管液体分别混匀，室温27℃放置过夜，再分别加入分离剂1000 μl，混匀，室温放置15分,离心（3500 r/min）15分,弃去上清液，用骨钙素测试仪（Capria l6，美国）测定各管沉淀的放射计数（cmp），经计算机处理，换算成样品的相应浓度值（ng/m1），取4孔均值。
2 结 果
