〔摘要〕 目的：为阐明牙齿发育的机制，探讨程序性细胞死亡（PCD）及其相关调控基因在牙齿发育中的作用。方法：利用原位末端标记法、原位杂交及免疫组化技术对SD大鼠牙齿发育不同时期PCD及Bcl-2、Bax基因的表达进行研究。结果：在牙胚发育早期的生长中心处PCD、Bcl-2、Bax mRNA及其蛋白的表达均很强，牙体组织形成后PCD及Bcl-2 mRNA蛋白的表达逐渐减弱，但Bax 蛋白的表达仍然明显。结论：Bcl-2、Bax基因及PCD可能是牙齿发育过程中的重要调控因素。
关键词 细胞程序性死亡；Bcl-2基因； Bax基因；牙齿；胚胎
研究表明，牙齿发育的早期，首先由上皮性信号诱导原口腔上皮增生形成牙板，继而增埴形成蕾状成釉器，同时，上皮性信号向间充质组织传递，间充质细胞增生形成细胞凝集区。这样，在上皮-间充质信号相互诱导下，上皮性成釉器及间充质牙乳头、牙囊细胞不断增埴、塑形完成发育过程，这一过程主要是受内在基因的调控［1］。那么，严密监控细胞生长状态、数量和质量的程序性细胞死亡（programmed cell death ，简称PCD）及相关基因Bcl-2、Bax的表达是否在牙齿发育中发挥重要作用，尚未见此方面的报道。为此，本研究通过观察SD大鼠牙齿发育中Bcl-2、Bax基因的表达与PCD的关系，探讨牙齿发育中Bcl-2、Bax基因及PCD的内在调控作用。
1 材料和方法
1.1 动物模型及标本制备
分别观察胚胎13、15、17、19 d及生后1、3、5、7 d SD胎鼠及幼鼠牙齿发育情况模型及标本制备方法见参考文献［3］。
1.2 原位末端标记法（TUNEL法）标记PCD细胞
TUNEL 方法见文献［2］。
1.3 原位杂交检测Bcl-2基因的表达
1.3.1 探针及标记：质粒pDOR-SB8.4（由第四军医大学生化教研室朱峰博士惠赠）含1.9kb的Bcl-2基因片段。取已鉴定的质粒DNA，经EcoRI酶切后，将目的基因用冻溶法回收。标记及检测见参考文献［3］。
1.4 免疫组织化学检测Bcl-2及Bax的表达
染色方法见参考文献［3］。
2 结 果
2.1 原位末端标记法染色结果 PCD阳性细胞细胞核为紫蓝色。结果显示，蕾状早期PCD阳性细胞集中在上皮细胞形成的蕾状突起头部。随着细胞增殖中轴区星形细胞增多，PCD阳性细胞也在其中增多，周围间充质组织中散在（图1）。帽状期，细胞增生活跃，PCD阳性细胞主要集中在内釉上皮凹面中心区域(原发性釉结节)、内外釉上皮细胞增殖形成的颈环处及其周围的牙乳头、牙囊中，余者散在。钟状期；主要集中在成釉器的未来牙尖形成部位（继发性釉结节）、颈环处及其周围的牙乳头、牙囊中。牙体组织形成期，随着冠部牙本质、牙釉质基质的形成, PCD阳性细胞集中在成釉器的星网层及牙乳头间充质细胞中，已分化的成牙本质细胞、成釉细胞中散在。
2.2 Bcl-2原位杂交结果 Bcl-2 mRNA阳性反应可出现于细胞浆和细胞核呈紫蓝色。牙齿发育的蕾状期各期蕾状突起头部及周围的间充质细胞均有明显阳性表达，其余细胞也表达阳性。帽状期、钟状期，细胞增殖中心部位：内釉上皮凹面中心区域、未来牙尖形成部位、颈环处及周围的牙乳头、牙囊中表达明显（图2），其余部位表达稍弱。牙体组织形成期，成牙本质细胞、成釉细胞、星网层、牙乳头、牙囊等表达逐渐减弱消失。
2.3 Bcl-2及Bax的免疫组织化学染色结果 Bcl-2及Bax 阳性细胞核膜及细胞浆着棕黄色。在牙齿发育过程中 Bcl-2蛋白的表达基本与Bcl-2mRNA表达一致（图3）。Bax在各期上皮及间充质细胞中表达基本与Bcl-2蛋白的表达相同；但在细胞生长中心处及牙体组织形成后的表达比Bcl-2明显（图4）。
图1 PCD阳性细胞集中在蕾状突起头部(40×6.7)
图2 钟状期成釉器的星网层中Bcl-2 mRNA阳性表达细胞(40×15)
图3 钟状期继发性釉结节内 Bcl-2蛋白阳性表达细胞(40×15)
图4 蕾状期上皮细胞及间充质细胞中Bax蛋白阳性表达(40×15)
3 讨 论
