摘要 目的:阐明细胞增殖与凋亡在牙齿发生、发育过程中的机制，探讨牙齿发育的机理。方法:选用纯系SD大鼠建立牙齿发育模型，采用原位末端标记法（TUNEL法）及免疫组织化学增殖细胞核抗原（PCNA）染色技术，观察分析纯系SD大鼠牙胚发育不同阶段细胞增殖及凋亡情况。结果:在牙齿发育的蕾状期、帽状期、钟状期增殖及凋亡的阳性细胞均出现在细胞增殖生长中心处。钟状晚期及牙体组织形成后，已分化的外釉上皮细胞、成釉细胞、成牙本质细胞中也可见，但以牙乳头及星网层细胞中多见。结论:牙齿发育过程中的细胞增殖与凋亡同时出现在生长中心部位，说明二者在牙齿发育中相互协调，共同控制牙齿的形态形成。
关键词 增殖细胞核抗原 细胞凋亡 发育 原位末端标记法
人体从胚胎开始到发育成熟不只是细胞增殖的过程。近年的许多研究发现细胞凋亡(apoptosis）又称为程序性细胞死亡（programmed cell death，简称PCD）在机体的胚胎发育、器官形成过程中发挥着重要的作用［1～3］。如果这对矛盾不能协调进行，将可能发生畸形甚至导致肿瘤的发生。关于这点在肿瘤方面已有许多研究，但在发育中尤其是牙齿发育所知甚少［2,3］。因此，本实验拟采用原位末端标记法（TUNEL法）及增殖细胞核抗原免疫组化技术较系统地观察和分析SD大鼠牙齿发育过程中的细胞增殖和凋亡的作用，以期揭示牙齿发育的机理。
1 材料和方法
1.1 动物模型建立
选用纯系SD（Sprape Dawley, SD）大鼠20只，3月龄，体重220～250 g，上海实验动物中心提供。每日随机按4∶1雌雄比例同笼，次日早8∶00观察雌鼠阴栓情况，有阴栓者为妊娠0天,标记后隔离饲养，记录生长情况。
1.2 标本制备
取妊娠SD雌鼠分别于胚胎13、15、17、19天及生后1、3、5、7天宰杀，剖腹取其胎鼠头部，固定在4％多聚甲醛溶液中，系列酒精脱水，石腊定向包埋，行冠状和矢状面5 μm切片。
1.3 免疫组织化学检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,简称PCNA)
免疫组织化学染色采用ABC法，石蜡切片脱蜡至水，经3% H2O2封闭内源性过氧化物酶及枸橼酸缓冲液微波修复抗原10分后，用正常羊血清封闭30分;加PCNA单抗（鼠抗大鼠，美国Santa Cruz公司产品)置于 4℃过夜，室温下复温1小时后滴加生物素化二抗37℃反应30分;再加ABC复合物37℃孵育30分,二氨基联苯氨(DAB）显色后，二甲苯透明,封片。
1．4 原位末端标记法（TUNEL法）标记PCD细胞
TUNEL（Tdt-mediated dUTP nick end labelling）法（试剂盒购自美国 Oncor公司）：切片常规脱蜡至水，室温下20 mg／L的蛋白酶K消化15分；3％H2O2的PBS溶液中处理5分后，加5 μl的平衡液（TUNEL试剂盒原配）1分；再加含TDT酶反应液15 μl，37℃反应l．5小时后用预热的中止反应液中止反应（TUNEL试剂盒原配）；缓冲液1漂洗2次(15 min/次）后加2％的正常羊血清孵育30分;滴加抗地高辛碱性磷酸酶抗体置于湿盒中孵育2小时;经缓冲液1、缓冲液3漂洗后，加新配制的显色液5-溴-4-氯-3-吲哚盐加硝基蓝四唑盐(NBT加BCIP)显色系统，用缓冲液3配制，NBT4.5 μl、BCIP 3.5 μl、0.24 mg/ml左旋咪唑20 μl，暗处显色。中止显色后，梯度酒精脱水，二甲苯透明封片。
2 结 果
2.l PCNA免疫组化观察
胚胎13天蕾状期,PCNA阳性细胞集中在蕾状突起中央部分，周围的上皮细胞及间充质细胞增生活跃，也散在可见阳性细胞（图l）。胚胎15天帽状期，细胞增生活跃，成釉器及牙乳头和牙囊已形成。PCNA阳性细胞主要集中在内釉上皮中心区域（原发性釉结节）及内外釉上皮细胞增殖形成颈环处，牙乳头中的间充质细胞中散在（图2）。胚胎17天钟状早期及19天钟状期，PCNA阳性细胞主要集中在成釉器的未来牙尖形成部位（继发性釉结节）及颈环处,间充质细胞中散在可见（图3）。出生后，牙本质牙釉质基质均已开始形成，成釉器逐渐退化，PCNA阳性细胞在星网层细胞多见，间充质细胞散在可见。随着牙本质、牙釉质基质逐渐分泌增加，成釉器不断退化，PCNA阳性细胞在成釉器的成釉细胞及成牙本质、间充质细胞中可见，其余部位逐渐少见。
