人牙髓干细胞无血清培养方法的研究进展

    人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）最先由Mooney等描述为干细胞，后于2000年证实存在于人牙髓组织中，是一种具有干细胞性质的未分化细胞，具有多向分化潜能，在再生医学方面具有巨大的潜力。
    目前，hDPSCs作为一种非侵入来源的干细胞，已被应用于治疗Ⅰ型糖尿病、神经疾病、免疫缺陷疾病以及骨和软骨疾病等。但人牙髓中干细胞含量极低，必须在体外进行扩增，以获得足够的细胞数量来满足应用需求。
    Gronthos等最初从人牙髓组织分离出牙髓干细胞后，其体外培养的方法采用αMEM（α modification of Eagle’s medium），添加20%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）以及多种抗生素。目前，国内外研究者仍主要通过在基础培养基中添加一定浓度的胎牛血清及抗生素培养及扩增牙髓干细胞，但同时也发展出多种不含血清的培养方法。
    1.干细胞培养方法的介绍和发展
    常见的干细胞培养方法，依据其是否使用血清，主要分为两类，即含血清培养方法和不含血清培养方法。
    1.1含血清培养方法
    1.1.1FBS
    FBS是体外培养细胞的重要补充剂，含有必要的成分，如激素、营养素、生长因子等。然而，除涉及动物伦理道德问题外，由于其为极其复杂的混合物，含有许多成分未知的组成部分，对其临床应用存在限制。首先，FBS存在携带细菌、病毒、支原体、蛋白传染性疾病或朊病毒的风险。其次，血清可能含有不同数量的内毒素、血红蛋白和其他有害因子，影响产品的安全性。
    此外，不同批次血清的质量和蛋白质浓度存在差异，影响实验的重复性。更有研究表明，FBS中包含的蛋白质和多肽即使在最低浓度下也可能会在培养过程中与干细胞结合，使干细胞受者体内产生抗牛蛋白抗体，引发免疫反应，并可能在需要重复注射的情况下导致移植细胞的排斥反应。
    1.1.2人来源血清
    近年来，有学者认为，从成人外周血和脐带血（umbilical cord，UC）中制备富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）和乏血小板血浆（platelet-poor plasma，PPP）在体外扩增干细胞，实验证明其比FBS具有更强的促有丝分裂作用，对干细胞迁移具有更好的促进效果。
    他们认为，这些人来源血清培养基可以替代含FBS的培养基，用于体外培养及冷冻保存人和大鼠的牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）。而在几种血浆中，脐带血来源的富血小板血浆在增殖、迁移方面更加具有优势，如0.1%浓度的脐带血来源的富血小板血浆对DPSCs的增殖作用可超过培养基中添加的多种生长因子的作用。
    Nakashima等进行牙髓再生临床试验时也采用10%自体血清作为DMEM（dulbecco’s modification of Eagle’s medium）的添加物而培养hDPSCs。此类培养基均为人来源血清，有自体应用前景，但其化学成分仍不明确，且使用过程中需要大量外周血或脐带血，无法满足大规模扩增干细胞的需求。
    1.2不含血清培养方法
    为了摆脱FBS的伦理争议和安全隐患，以及人来源血清的供需矛盾，迫切需要开发应用无血清培养基。然而，无血清培养基对实验技术要求更高，技术体系暂不成熟，且有研究显示，无血清培养的DPSCs对外源性细胞毒性刺激如H2O2和紫外光更敏感，提示：不含FBS的培养液培养的细胞可能易受外源性细胞毒性的影响，在一定程度上影响干细胞的生长。因此，无血清培养基未能在市场上广泛使用，还需要进一步的研究。
    尽管如此，目前市场上也已开发出多种无血清培养基，适合不同细胞的生长增殖，且均由营养完全的基础培养基添加一定数量的添加因子均匀混合组成。基础培养基的成分已知，常见的有MEM（modification of Eagle’s medium）、DMEM等。
    添加因子按其功能的不同一般分为5类：1）促贴壁因子，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。2）激素和促生长因子，激素如胰岛素；生长因子包括表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）等。3）结合蛋白和转运蛋白。4）酶抑制剂：常用大豆胰酶抑制剂。5）其他微量元素，如硒等。
    无血清培养基经过多年的发展，目前已开发出完全不含血清、无蛋白或蛋白含量极低的培养基，即“双无培养基”，具有以下优势：1）内容物明确，增加了实验的科学性和可靠性；2）成分比例一致，增加了实验的重复性；3）无蛋白成分，有利于纯化和下游加工；4）从根本上消除了血清源性或蛋白源性污染。
    2.hDPSCs的无血清培养方法
    2.1无血清培养方法分类
    无血清培养hDPSCs的方法主要可以分为2类：1）血清条件下进行初代培养，后更换至无血清培养基中；2）全程无血清条件培养。普遍认为，在运送组织样本以及在原代培养分离干细胞时，FBS的使用是必需的，尤其是在原代培养或者细胞生长状况不良时，常常会先使用有血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培养液。
    同时，也有研究表明，无血清培养的DPSCs对外源性细胞毒性刺激如H2O2和紫外光更敏感，这表明不含FBS的培养液培养的细胞可能易受外源性细胞毒性的影响。因此，在大多数有关无血清培养DPSCs的实验中，研究者们仍然选择第一种方法，即先用含FBS培养基培养一段时间，再更换到无血清培养基中。
    然而，Mochizuki等认为，在传统的含血清培养基中培养原代细胞即使只有一次也会引起安全问题；因此，他们在整个hDPSCs的培养过程中均未使用血清，结果发现细胞黏附力降低，形态变薄，提示：原代培养使用无血清培养基会对细胞生长产生或多或少的不利影响。
    Abdel Moniem等在干细胞培养过程中只有在传代培养细胞胰蛋白酶失活时使用了最低浓度的FBS，他们建议在之后的研究中尝试采用机械分离或用危害小的蛋白酶（如重组胰蛋白酶）取代胰蛋白酶，以确保细胞不会受到任何血清来源的影响。最近有研究便采用了后者的方法，运用消化酶AccutaseTM建立了一种从分离到培养和分化诱导全过程的无血清培养方法，发现培养的hDPSCs可以和在常规培养条件下一样增殖，提示全程无血清条件培养方法具有一定的可行性。
    2.2无血清培养基添加因子的研究进展
    有一些有关基础培养基中添加因子组成和配比的研究，如Hirata等尝试对比4种添加不同因子的无血清培养基，结果发现含1%胰岛素转铁蛋白硒（insul intransferrin selenium，ITS）-Ⅹ和100mg·mL-1胚胎营养因子（embryotrophicfactor，ETF）最适合hDPSCs的培养，具有较高的存活率和增殖率，且干细胞标志物中表达最强。
    Machado等在有血清和无血清的条件下，在培养基中分别添加不同浓度的葡萄糖和谷氨酰胺，发现在去谷氨酰胺的无血清低糖培养基中培养的细胞具有较好的形态和活力。有研究表明，在培养hDPSCs时应用较多的有几种双无培养基。
    Bakopoulou等对2种商业化的双无培养体系StemPro和StemMacs进行了评估并建议作为含血清培养基的替代品。然而，考虑到制造商往往不提供关于配方的信息，可能会导致样本之间缺乏直接比较，还需要进一步的测试。
    Xiao等使用E8（Essential8）培养基进行hDPSCs的细胞培养实验。这是一种相对成熟的无血清培养基，常用于临床和研究用途的诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）培养，其中一些成分如重组人碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、转化生长因子β1和胰岛素对hDPSCs的维持和生长是必要的，具有很强的实用性。
    有研究报道，一种双无培养基的新配方，添加因子包括bFGF、ITS、抗坏血酸、β-巯基乙醇和胆固醇，成功地增加了hDPSCs的增殖潜能和干性，是一种安全且具有应用潜力的血清培养基替代品。
    综上，完全无血清的培养方法显然能够彻底避免血清的伦理及安全问题，但也可能会对hDPSCs的稳定生长产生一定的影响。这需要深入的研究论证，并为解决这些问题寻找无血清培养基更适合的添加因子，例如ITS-Ⅹ、ETF等。
    对于制造商较为成熟的无血清培养基，由于其配方信息未知，也需要经过进一步的测试，以明确其对hDPSCs生物性能的影响。
    3.无血清培养hDPSCs的细胞特性
    3.1细胞形态
    研究显示，用无血清培养基扩增的hDPSCs表现出非常均匀的形态，梭形细胞排列整齐。相反，含FBS培养基扩增的hDPSCs表现为形状和大小不一。Mochizuki等早在原代培养中就开始使用无血清培养基，发现虽然单个细胞大小与血清培养的细胞相似，但黏附率较低，形态明显变薄，且呈梭形。
    Qu等以及钟萌等的实验结果均证实了这一观点，即与含FBS培养基相比，在无血清培养基中培养的hDPSCs显示出更细长、更薄、更立体、更近纺锤形的成纤维细胞形态。
    3.2细胞增殖
    与含FBS的培养基相比，关于无血清培养基对细胞增殖的影响目前存在相互矛盾的结论，这可能是由研究中供体的不同特性、使用的培养基的成分不同或培养方法的差异所致。早期有学者应用低血清培养基，观察到其分离后的贴壁细胞数量明显低于高血清培养基，认为低血清培养基可能会对hDPSCs的增殖产生不利影响。
    有研究通过增殖实验发现，几种无血清配方的培养基培养的hDPSCs增殖能力远低于含血清培养基培养的hDPSCs。但在无血清培养基中，其中同时添加1%ITS-Ⅹ和100mg·mL-1ETF与单独添加1%ITS-Ⅹ或100mg·mL-1ETF等配方相比，增殖能力较高且具有明显差异。
    有学者应用低血清培养基，观察到其分离后的贴壁细胞数量明显低于高血清培养基，认为低血清培养基可能会对hDPSCs的增殖产生不利影响。然而，Bakopoulou等发现在无血清条件下扩增的hDPSCs在连续传代过程中产生了与血清培养相似的生长模式，且在完成不超过3代（早期）传代后，已能够实现超过3000万个细胞的细胞产量。
    Fujii等的实验通过分析hDPSCs基因表达谱，发现在无血清培养基中，胎盘生长因子和抑制素等与细胞增殖相关的基因表达上调。有研究证实，hDPSCs在无血清培养基中的扩增方式与血清培养在早期传代时没有明显差异，但前者中细胞集落数量较少。
    在培养基的添加因子方面，Xiao等发现，含抗坏血酸和ETF的特殊无血清培养基，可能通过加快细胞分裂速度以及降低细胞凋亡率，来提高hDPSCs的增殖率。采用全程无血清的培养方法时，Mochizuki等报道虽然无血清培养基原代培养条件下hDPSCs在培养皿上黏附需要更长的时间，但传代培养时无血清培养条件下的hDPSCs比有血清培养条件下具有更强的增殖能力。
    另有研究通过实验发现，hDPSCs在无血清培养基中的增殖率明显提高，与常规10%FBS培养基相比，在培养第7天时分离获得的细胞数量没有显著差异，但在培养第14天时获得细胞数量更多。此外，值得注意的是，Mochizuki等发现，当细胞达到过度融合时，无血清细胞形成了多层结构，增殖受阻，不能传代，而血清培养细胞则为单层结构。
    通过观察，他们认为这种异常的细胞增殖行为可能由于这些细胞的“接触抑制”减弱，异种血清成分的存在可能有助于接触抑制，并控制细胞的正常增殖行为。另外，体外培养hDPSCs时要注意其存在明显的与年龄有关的细胞增殖的差异，研究表明，年龄相关的衰老影响hDPSCs的增殖和分化能力。
    和年轻供体相比，年老的供体来源的hDPSCs增殖能力明显下降。由上述研究分析可知，无血清培养基对hDPSCs增殖的影响存在相互矛盾的结论，这可能是由研究中供体的特性不同、培养基成分不同或培养方法的差异所致。新的研究结果提示，在体外培养hDPSCs时应尽可能选用年轻供体，无血清培养基的添加因子可以适当选用ITS-X、ETF以及抗坏血酸等。采用无血清培养方法扩增细胞时早期增殖能力可能会相对较弱，传代培养后会逐渐增强，甚至超过含血清培养方法的细胞。但应注意避免过度培养至过度融合，因为这会破坏细胞的增殖和进一步培养的潜力。
    3.3细胞干性
    多个课题组研究了无血清培养的hDPSCs的MSC相关的各种标记物，通过其表达差别来探究无血清培养对细胞干性的影响。
    3.3.1干细胞重要标记物的表达
    CD146具有黏附分子特性，与多种肿瘤的发生发展、转移、治疗和预后密切相关，是某些内皮、平滑肌细胞和血管周围间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）的标记物。低血清或无血清培养基扩增的hDSPCs的研究发现，表面CD146表达明显减少。同时，更换使用含有大量血清的培养基可以恢复65%以上的CD146阳性细胞，但不能完全恢复CD146的表达。
    类似的研究也证实在无血清培养基中培养的小鼠DPSCs存在CD146表达。CD105是一种跨膜糖蛋白，通常被认为是MSC最重要的标记物之一。与常规血清培养相比，研究显示，无血清条件早期培养（2~3代）hDPSCs时CD105的表达减少，而在长时间传代后（6~7代，10~11代）显示出更明显的下调。
    另有学者进行细胞鉴定时发现，无血清培养基扩增的hDPSCs呈现CD105阳性，但随着传代次数的增加（即使是仅3代之后），CD105阳性的hDPSCs的百分率明显降低，而血清培养的细胞则多呈阳性。有趣的是，将无血清培养的hDPSCs换至添加血清的培养基中，可恢复CD105的表达。
    尽管在无血清培养基中扩增的hDPSCs的CD105表达水平降低，但仍可保持功能性的MSC表型。并且，考虑到人血清是模拟细胞用于移植时体内条件的金标准，CD105的表达很可能在体内移植时暴露在血清中后得以恢复。
    与此相反，另一项研究显示，CD105在无血清培养hDPSCs中的表达非常低且培养过程中没有明显改变。CD34是早期分离的MSC的重要标记物，与高集落形成效率和延长增殖能力相关，但其表达随着传代而逐渐减弱。有报道称，无血清培养下的hDPSCs造血标志物CD45及CD34表达呈阴性，但长期扩增后CD34表达明显上调，与先前报告一致。
    另外，从传代早期到后期，公认的MSC标记物如CD90和CD73在基于血清和无血清培养条件下都能稳定地表达。然而，有学者发现，其他MSC标记如Stro-1和胚胎标记阶段特异性Embyronic抗原（stage-specific Embyronic antigen，SSEA）-1和SSEA-4，在无血清培养多代后显示出明显的下调，是否会因此而影响hDPSCs的干性，需要进一步实验予以补充完善。
    3.3.2成骨、成软骨及成脂标志物的表达
    早期研究表明，成骨和成软骨受到Runx2转录调控通路调控，软骨形成受到SOX-9的强烈调控，而成脂受到其主要转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR）-γ调控。
    研究显示，无血清条件下扩增hDPSCs会导致其成骨标志物Runx2表达增加，成软骨标志物SOX-9和成脂标志物PPAR-γ完全消失，而对比含血清条件下扩增只有成骨标志物的变化，成脂和成软骨的变化不明显。
    经过多次传代后，大多数最初高表达的成骨标志物的表达减少，成软骨标志物表达显著减少或完全消失。因此，学者们提出hDPSCs只能在早期传代时确定可以保持高的成骨及成软骨潜力。然而，也有学者进行诱导分化实验，结果显示，在诱导分化刺激存在的情况下，无血清培养的hDPSCs中Runx2和PPAR-γ的表达水平均较高，提示无血清培养条件或能有效地维持hDPSCs向成骨和成脂组织的多向分化潜能。
    研究显示，无血清培养细胞的干细胞标记OCT4、SOX和NANOG基因的表达显著上调，提示细胞的干性增强，但可能是由于培养基中添加因子的原因。实验发现，在诱导成骨后，在无血清培养基中生长的hDPSCs诱导碱性磷酸酶活性和钙化结节形成水平均高于有血清培养基组，表明hDPSCs在无血清培养条件下保持了成骨分化潜能。
    3.3.3神经相关标记物的表达
    除此之外，趋化因子CXC亚家族受体（CXC subfamily receptor，CXCR）3与神经炎性反应有关，其阳性细胞在牙髓免疫反应中可被CXC趋化因子配体10吸引。有学者观察无血清培养的贴壁hDPSCs发现，70%的细胞表达神经细胞黏附分子CD56，30%表达转铁蛋白受体CD71。
    另有少部分hDPSCs表达CXCR3阳性，这部分hDPSCs可能具有迁移到需要修复区域的能力，可应用于细胞治疗中。同时，在神经分化方面，多个研究团队观察到，在无血清培养的情况下，来自不同患者供体的hDPSCs可以长期培养，并表达神经前体细胞标记物Nestin。
    同时，其他神经标记物如微管相关蛋白（microtubule associated protein，MAP）2、微管蛋白β3等也被证实高度表达。研究显示，无血清培养条件下，神经元诱导刺激hDPSCs后可以获得类似表型的成熟神经元。
    有学者通过观察细胞形态学变化、MAP2的表达、以及神经元标志物的激活，证实培养过程中若缺乏血清和生长因子，可能会导致hDPSCs向神经元样细胞向分化，获得类似表型的成熟神经元。
    3.3.4其他分化方向
    除以上方向之外，还有研究揭示了无血清条件下诱导hDPSCs成其他细胞系的可能性。学者们在无血清条件下成功诱导hDPSCs分化为高纯度的肝细胞样细胞，以及胰岛细胞系。除此之外，还有学者进行细胞培养以及体外血管生成实验证实，无血清条件培养的hDPSCs在传代至第2代和第6代时血管内皮生长因子A的分泌明显增加，提示无血清培养基可能比含血清培养基更能促进毛细管样的形成。
    由上述结果可知，无血清培养的hDPSCs与含血清培养的hDPSCs相比，其多能分化潜能没有明显的差异，在体外和体内表现出典型的MSC特征，且更容易诱导神经分化以及毛细管样形成。hDPSCs作为从牙齿组织中提取的干细胞，在无血清条件下增殖分化，对口腔科学和再生医学具有重要的意义。
    4.hDPSCs无血清培养方法的其他应用
    4.1三维培养系统
    在干细胞研究中，二维单层细胞培养系统便于对干细胞和测试其多能性等特性的鉴定。但是，相比于单层培养系统，三维球体培养系统更能反映体内细胞环境和细胞行为。以往的三维培养系统多采用血清培养的方法，但由于使用血清存在安全隐患，不适用于临床，学者们对无血清三维培养系统进行了多项改进。
    相较于骨髓MSC，hDPSCs具有更高的神经球形成和分化为神经元的潜力，因为其与神经嵴细胞有着共同的起源。有学者发现在无血清培养基中人牙髓细胞24h即可以自发形成球体，且可以存活15周以上。据报道，EGF和/或bFGF对细胞增殖及形成球形结构具有作用。
    研究显示，hDPSCs在全程无血清培养条件下可以在悬液中生成神经球，并分化为神经细胞，但传代培养后形成的神经球数目变少，形态变小。因此，在无血清培养基中，hDPSCs可以增殖并生成神经球，但神经球的自我更新能力有限。这种球体模型为探索干细胞稳态和组织结构的分子基础提供了研究方法，且hDPSCs在无血清条件下生成神经球的特点，未来可能用于临床上神经元退行性疾病的治疗。
    4.2冷冻保存
    在再生医学的临床应用过程中，简单可靠的活细胞冷冻保存方法是非常重要的。传统的冷冻方法一般含有血清及10%二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）。但血清存在安全隐患，且DMSO具有细胞毒性，在干细胞冻存中应尽量减少使用浓度或不使用。
    Lee等推荐应用磁冷冻法储存hDPSCs，通过实验对比不同的冻存液和冻存条件的效果，发现在无血清培养基中加入最低浓度的DMSO同时处于磁场下进行冷冻时，解冻细胞的贴壁能力、增殖能力和干细胞标志物的表达均得到较好的保存，且具有与新鲜未冻存hDPSCs相同的分化潜能。
    Mochizuki等使用无DMSO低温保存的无血清培养hDPSCs进行体内外实验，结果表明解冻后的细胞表现出与正常细胞相似的干细胞特性和增殖行为。目前，此类研究结果仍然较少，不过仍然提示无血清培养基可应用于hDPSCs的超低温保存，具有重要的临床应用价值。