唾液蛋白作为低龄儿童龋预测标志物的研究进展

    龋病是婴幼儿最常见的牙齿问题之一。6岁以下儿童的任何一颗乳牙中存在一个或多个龋（无论是否形成龋洞）、失（因龋所致牙齿缺失）、补（牙齿充填），即可称为低龄儿童龋（early childhood caries，ECC）。该年龄段儿童的严重龋齿又称为重度低龄儿童龋（severe early childhood caries，S-ECC），满足以下3个条件之一即可诊断：3岁以下儿童出现光滑面龋，3~5岁儿童上颌前牙出现光滑面龋，或是龋失补指数≥4（3岁）、≥5（4岁）、≥6（5岁）。
    ECC不仅降低咀嚼功能，当感染波及根尖周组织后，还会对恒牙的发育及萌出造成影响，更有甚者会引发全身感染，影响儿童的生长发育和心理健康。我国第4次全国口腔健康流行病学调查结果显示：我国儿童患龋情况呈现上升态势，5岁儿童乳牙患龋率为70.9%，比10年前上升了5.8个百分点。
    由于监护人对儿童口腔卫生及乳牙龋缺乏重视，加之ECC进展十分迅速，因此很多患儿就诊时已患有S-ECC。如何有效预测儿童龋的发生，做到未病先防，是现阶段儿童口腔工作的重点和难点。临床上常通过综合评估患龋风险预测龋病的发生，但由于龋病病因复杂且多，各模型判断标准存在差异，目前尚无统一的龋风险预测模型。
   有研究发现：唾液蛋白可通过直接抗菌及阻碍致龋菌黏附定植等多种防御机制在ECC中发挥重要作用，并且唾液蛋白水平与宿主龋病易感性之间存在关联，因而有学者提出，可以利用唾液蛋白作为生物标志物评估龋风险。本文对唾液蛋白在ECC中的作用机制及不同的唾液蛋白可否作为预测ECC的生物标志物进行综述。
    1.抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）
    AMPs是生物体内经诱导产生的具有抗菌活性的小分子多肽，主要以防御素（defensin）家族和cathelicidin家族为代表，在ECC的进展过程中发挥重要作用。
    1.1防御素
    防御素是一种低相对分子质量的阳离子抗菌肽，可分为α-防御素（human neutrophil peptide，hNP）和β-防御素（human beta defensin，hBD）两种。目前在人体中已发现6种hNP和4种hBD，其中hNP来源于中性粒细胞，而hBD则由上皮细胞产生，口腔中仅表达hNP-1、hNP-2、hNP-3、hNP-4、hBD-1、hBD-2、hBD-3。
    防御素具有直接抗菌和调节宿主免疫反应的双重作用，是口腔天然防御系统的一部分。防御素可通过静电力作用引起微生物细胞膜裂解，发挥其抗菌作用。目前已有研究证实：防御素，尤其是hBD，对变异链球菌等致龋菌具有直接抗菌作用。
    另外还有研究显示：防御素的各个成分之间，以及防御素和其他抗菌肽之间存在协同作用，可共同抵抗变异链球菌。此外，防御素还可通过促进树突状细胞的抗原呈递作用引发宿主免疫反应，发挥间接抗菌作用，但目前尚无研究证明ECC中也存在此机制。
    一些学者提出ECC中防御素可能通过影响牙菌斑生物膜中的优势菌群，从而发挥抗龋作用。Jurczak等认为防御素可能影响包括链球菌在内的多种细菌在牙菌斑生物膜中的定植。Phattarataratip等则发现：分离自龋齿儿童的变异链球菌临床株对唾液hNP-1、hNP-2和hBD-2、hBD-3的抵抗力较无龋儿童更高，并认为此类抵抗力高的菌株在ECC患儿牙菌斑中更具生态优势。然而，目前的研究尚未明确唾液中防御素的浓度与ECC严重程度之间的关系。
    部分学者报道两者之间并无明确关联。如Toomarian等发现：S-ECC、ECC患儿和无龋儿童之间的唾液hNP（hNP-1、hNP-2、hNP-3）水平缺乏明显差异。Colombo等也发现：hBD（hBD-2、hBD-3）的含量在上述3组之间无明显变化。还有部分学者发现ECC患儿唾液内部分防御素成分呈现明显的下降趋势。如一项开展于巴西儿童的试验显示：hBD-1在患有ECC的儿童体内水平更低；hNP-3和hBD-3也被发现在ECC患儿唾液中具有较低的浓度。
    此外，也有学者发现一些防御素成分在ECC患儿中增多，如Jurczak等发现ECC患儿唾液内hBD-2水平升高。上述研究表明，防御素与ECC之间目前仍缺乏明确的关联，这可能是由于不同个体间防御素水平存在差异，进而对实验结果造成了影响。综上，目前尚无充分的证据表明防御素可作为ECC预测的生物标志物，其与ECC风险的相关性仍需要进一步的研究。
    1.2人源抗菌肽LL-37（human cathelicidin LL-37）
    人源抗菌肽LL-37由中性粒细胞和上皮细胞产生，属于抗菌肽cathelicidin家族。LL-37对致龋菌中的变异链球菌有很强的抗菌活性，带有正电荷的LL-37作用于带有负电荷的细菌细胞壁，在细胞壁上形成孔状结构，引起细菌裂解；此外，LL-37还参与调控机体的天然免疫。
    目前有关LL-37在ECC中作用具体机制的研究还很少。Colombo等对36名60个月大儿童的唾液成分进行分析，发现LL-37水平与患龋经历间仅存在弱相关性，但与其他抗菌肽如hBD-2、hBD-3之间呈现明显的正相关关系。该结果提示抗菌肽的不同成分之间可能存在相互促进的机制，各成分协同在ECC中发挥作用。
    此外，Davidopoulou等发现：与无龋儿童相比，低中度龋患儿唾液LL-37增高，而LL-37在S-ECC患儿中的水平却较前两者明显降低，作者由此推测LL-37可能具有保护作用。另外还有研究表明LL-37可以抑制龋病相关厌氧菌形成生物膜，并且这种抑制作用的发挥受其浓度影响，这为Davidopoulou等的推测提供了依据。
    LL-37可能是口腔中重要的先天免疫因子，在ECC的进展过程中起保护作用，但其水平高低与ECC易感性之间的关系尚不明晰，仍需进一步研究。
    2.糖蛋白（glycoproteins）
    唾液糖蛋白是一类含有寡糖链的蛋白质，参与牙菌斑生物膜的形成，影响致龋菌的黏附和定植，其中的许多成分在ECC中扮演着重要的角色。
    2.1富脯蛋白（proline-rich proteins，PRPs）
    PRPs主要由腮腺分泌，是一类富含甘氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸的蛋白质，可分为酸性和碱性两类。酸性PRPs通过其N-端黏附在羟磷灰石上，并通过C-端与细菌结合，参与致龋菌黏附牙面的过程。碱性PRPs则可以与细菌或多酚结合，降低食物的涩味，减少饮食中糖的摄入，具有预防龋病发生的作用。
    研究发现ECC患儿的总PRPs水平低于无龋患儿。Bhalla等通过凝胶电泳图谱观察到ECC患儿PRPs条带数量较无龋儿童低；Fonteles等则发现ECC患儿较无龋儿童唾液内存在更多的游离脯氨酸，并指出是由于微生物分解唾液蛋白导致的。除总PRPs外，还有研究发现酸性PRPs与ECC的关系十分密切，可能是由于其在变异链球菌的黏附过程中发挥重要作用所致。
    有学者研究酸性PRPs基因多态性与ECC之间的联系，结果发现：酸性PRPs由2个基因PRH1和PRH2编码，其中PRH1基因座包含Db、Pa和Pif共3个等位基因。Zakhary等通过对比不同人种受试者唾液中上述基因的表达，发现Db基因可用于解释不同人种间ECC患病率的差异，即Db基因频率低的高加索儿童较基因频率高的非裔美国儿童更易患龋。
    此外，PRH1和PRH2基因表达的差异也造成了个体对龋病易感性的不同，然而具体机制仍不详。另有研究发现ECC可能与缺乏某些PRH基因有关。与酸性PRPs不同，关于碱性PRPs与ECC关系的认识尚不充足，仅有少数研究表明碱性PRPs水解产物IB-4的升高增加了患ECC的风险，这可能是因为原本具有防龋作用的碱性PRPs水解后失去了其保护功能。
    根据目前的研究结果可以看出，酸性PRPs基因表达可作为预测ECC易感性的潜在指标，但是目前缺乏充足的证据证明碱性PRPs与ECC之间的联系。
    2.2富组蛋白（histidine-rich proteins，HRPs）
    HRPs中含有12个组分，其中HRP-1、HRP-3和HRP-5被称为主要富组蛋白。HRPs不仅具有直接抑菌的作用，而且可以中和细菌产生的酸，阻止龋病进展。此外，也有一些学者将HRPs归为抗菌肽类别下，并发现HRP-5与其他抗菌肽如防御素、LL-37之间存在协同抗龋作用。
    HRPs在ECC中显示出明显的升高趋势，以HRP-1和HRP-5为代表。研究显示：HRP-1和HRP-5在ECC患儿唾液内的水平较无龋儿童显著升高，推测原因是由于ECC的存在刺激了HRPs的分泌。Ao等进行的纵向研究表明：通过质谱分析发现HRPs的水解肽段含量随ECC的进展不断升高，能反映ECC发展的情况。目前的研究显示HRPs具有抗龋能力，但在ECC中却表现出明显的升高趋势。
    2.3富酪蛋白（statherin）
    富酪蛋白由腺泡细胞分泌，在结构和功能上与富组蛋白十分相似。研究表明：富酪蛋白作为一种小唾液蛋白，可以竞争性抑制高相对分子质量黏蛋白MG1，进而阻碍变异链球菌黏附在牙面上。
    李远贵等研究了儿童唾液富酪蛋白与患龋状况的联系，结果发现：龋病高危组儿童的唾液富酪蛋白浓度低于无龋组，作者认为这可能提示不同龋易感性个体代谢降解富酪蛋白的能力存在差异。目前关于富酪蛋白在ECC中作用机制的研究较少，是否可作为ECC的预测指标尚不明确。
    2.4黏蛋白（mucin）
    黏蛋白主要由下颌下腺、舌下腺和小唾液腺分泌。唾液中的黏蛋白存在两种类型：由muc5b基因编码的高相对分子质量黏蛋白MG1和由muc7基因编码的低相对分子质量黏蛋白MG2。这两种类型的黏蛋白均与牙菌斑形成和细菌黏附有关。MG1主要参与获得性膜的形成；而MG2是一种抗菌蛋白，可以促进细菌聚集，使其更易被清除出口腔。目前的研究显示：ECC患儿唾液内MG1水平下降，相反MG2水平上升。
    ECC组受试者唾液内MG1的含量随ECC的进展逐渐降低。鄢国伟等通过电喷雾离子肼-串联质谱分析发现：SECC患儿唾液内MG2水平明显高于无龋组。Angwaravong等的研究显示：学龄儿童（9~11岁）患龋后唾液MG1降低、MG2升高；但在更为关注的患龋学龄前儿童（4~6岁）的研究中，学龄前儿童唾液中并未观察到上述黏蛋白水平的变化。综合上述研究可知：黏蛋白的两个组分在功能上存在差异，在ECC进展过程中呈现完全不同的变化趋势，即MG1降低而MG2增高，因此黏蛋白可能是预测ECC风险的潜在指标。
    2.5乳铁蛋白（lactoferrin，LTF）
    LTF是一种特殊的糖蛋白，具有螯合铁离子的能力，可以利用细菌生长代谢所需的铁离子，使细菌获得的铁离子减少，进而起到抑菌作用；同时LTF也可以通过影响变异链球菌的黏附和激活免疫系统来表现抗菌活性。
国内外多项研究均发现S-ECC和ECC患儿唾液内的LTF含量显著高于无龋组，且经过治疗后唾液乳铁蛋白水平降低。上述研究均观察到ECC患儿唾液LTF水平高于无龋儿童的现象，但目前尚无直接证据证明LTF具有保护作用。
    Moslemi等认为：LTF水平的改变属于一种补偿机制，该机制作用的具体条件仍需进一步研究。此外Abbasoğlu等发现：LTF的基因多态性与土耳其儿童的龋患率低有关；但目前尚未发现LTF与我国ECC患儿患龋经历存在关联。
    LTF在ECC进展过程中展现出了较为明确的升高趋势，但关于其基因多态性与龋易感性之间的联系仍需进一步研究，未来可能成为ECC的风险预测指标。
    3.酶
    酶是唾液中重要的有机成分。不同的酶可通过直接抗菌、调节唾液pH等多种方式密切参与龋病的进展。唾液酶中，溶菌酶（lysozyme）、碳酸酐酶、基质金属蛋白酶等均与ECC之间存在关联。
    3.1溶菌酶
    溶菌酶是唾液先天防御系统的重要组成部分，可以与革兰阴性细菌的脂多糖发生结合，除直接杀菌和促进细菌凝集的作用外，还可以破坏细菌细胞壁，进而溶解细菌；此外，溶菌酶还抑制生物膜形成，阻碍变异链球菌对牙面的黏附。
    多数研究表明溶菌酶含量在ECC患儿唾液中较无龋儿童升高，但仍有少数研究发现ECC组患儿唾液溶菌酶水平低于无龋组。一项开展于泰国学龄前儿童的研究显示：S-ECC组患儿的唾液溶菌酶水平和活性均显著增加，提示溶菌酶在ECC进展过程中发挥着重要的免疫防御作用。由上述研究可以看出：溶菌酶的升高可能具有标记ECC进展情况的潜力，但仍需更多的证据来证实。
    3.2碳酸酐酶Ⅵ（carbonic anhydrase Ⅵ）
    碳酸酐酶Ⅵ深度参与唾液缓冲、离子运输、pH调节以及唾液产生和分泌等生理过程。de-Sousa等发现：ECC患儿唾液和生物膜内的碳酸酐酶Ⅵ水平均增高，认为该酶可与pH值一同作为预测ECC的指标。然而侯雯等的研究得出了相反的结果。他们在一项4~5岁儿童的研究中发现：相较于无龋儿童，ECC患儿唾液和菌斑中的碳酸酐酶Ⅵ含量均呈现下降趋势。由于不同研究对于碳酸酐酶Ⅵ与ECC之间的联系尚无定论，尚需进一步研究才能确定碳酸酐酶Ⅵ能否用于预测ECC。
    3.3基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）
    MMPs既能促进龋病进展，又参与修复性牙本质形成，但具体机制尚不明确。有研究证明：S-ECC患儿唾液中的MMP-2、MMP-9水平明显高于无龋儿童，即使经过治疗仍高于健康儿童，这提示MMP-2和MMP-9可能在ECC的进程中发挥作用，但是否可用于ECC预测仍需进一步研究。
    4.免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）
    唾液Ig的成分主要是IgA和IgG，另有少量的IgM、IgD和IgE，其中的分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，sIgA）在口腔局部免疫中发挥重要作用，是抵抗病原体的第一道防线。sIgA可通过抑制致龋菌黏附，使细菌酶和毒素失活，以及激活补体通路等多方面的功能发挥防龋作用，并且可以与口腔内其他防御机制协同对抗病原体。
    已有多项研究来验证sIgA与ECC之间的关系，结果表明：ECC患儿唾液内sIgA的平均浓度显著高于无龋儿童，而S-ECC组患儿的唾液sIgA水平则低于无龋组。还有研究利用龋齿颗数、龋失补牙面指数对ECC患儿患龋情况进行分级，结果发现随龋病程度加重，唾液sIgA水平也下降。
    目前普遍认为造成上述改变的原因有二：一是患龋后致龋菌刺激机体产生大量的sIgA以应对病原体入侵，但随着sIgA与变异链球菌葡糖基转移酶（glucosyltransferase，GTF）的结合，其浓度下降；二是由于变异链球菌会同时分泌IgA蛋白酶裂解sIgA。
    但也有一些学者观察到sIgA可以通过某种未知机制抵御蛋白酶。此外，也有研究显示sIgA含量与变异链球菌数量之间存在正相关关系，证实了sIgA的保护作用。除总sIgA外，也有学者研究了ECC中不同抗原表位诱导的特异性sIgA的水平，结果发现：针对变异链球菌葡聚糖结合蛋白B（glucan binding protein B，GbpB）的sIgA水平呈现下降趋势，而针对抗原AgⅠ/Ⅱ和GTF的特异性sIgA水平却并未呈现明显变化。推测这可能是因为唾液中特异性sIgA含量较低，所以变化并不明显。
    综上所述，sIgA含量在ECC患儿唾液内升高，而在S-ECC患儿唾液内则下降，并且随龋病程度加重，唾液sIgA水平逐渐下降。特异性sIgA因浓度较低，尚未展现出明显的变化趋势。由此可以推测：sIgA具有潜在的反映ECC易感性的能力。此外，也有一些针对IgG、IgM与ECC关系的研究，但目前尚无充分证据证实这些蛋白与ECC的联系。
    5.唾液总蛋白
    本文分别描述了不同唾液蛋白成分在ECC中的作用机制及其是否具备作为生物标志物的潜力。因为唾液中的蛋白通过多种方式相互作用，因此有学者建议将不同种唾液蛋白视为同一系统的组成部分，评估唾液总蛋白水平与ECC的关系。尽管部分研究发现二者之间缺乏明显关联，但大多数研究均表明ECC组患儿唾液总蛋白水平明显提高，且差异蛋白主要集中在低丰度区域。
    唾液总蛋白水平的变化可能是因为患龋后刺激产生防御性蛋白，后者通过直接抗菌以及抑制致龋菌黏附等机制发挥作用；但目前尚无证据表明唾液总蛋白水平可作为ECC龋风险评估的指标。
    6.小结
    综上所述，一些唾液蛋白成分如酸性PRPs、富组蛋白、黏蛋白、溶菌酶、sIgA等与ECC关系密切，在ECC中发挥重要作用。酸性PRPs基因在早期预测个体ECC易感性方面展现出了较高的应用价值；而富组蛋白则是一种可用于反映ECC进展情况的蛋白。
    然而现有的研究一般每次只研究1~2种蛋白成分，忽视了唾液蛋白各组分间的相互作用。随着唾液蛋白质组学的不断发展，未来或许可实现对唾液蛋白全面且系统的分析，深入研究不同唾液蛋白之间的作用机制，建立起几种蛋白的综合评估模型用以预测ECC发生，进而成为精准高效的ECC预测工具。