根尖周炎低氧微环境下自噬调控骨吸收研究进展

    根尖周炎是一种发生在牙根尖周组织的炎症性疾病，绝大多数根尖周炎继发于牙髓病。当牙髓炎症坏死累及根尖周组织时，根尖周组织发生急性或慢性的炎症反应，炎症部位产生大量的炎症因子，分化出大量破骨细胞，继而引发牙槽骨的破坏和吸收。
    在正常条件下，由于牙髓腔的特殊解剖结构，血管只能经过狭窄的根尖孔给根尖周组织供氧，因此根尖周组织内氧气浓度较低。在炎症情况下，牙髓腔血管内压力增高，供氧更加困难，导致根尖周组织处于缺氧环境中。在乏氧条件下，缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）可稳定表达并调控破骨细胞的自噬，而自噬是破骨细胞形成和骨吸收的主要刺激因子。
    近来研究发现，自噬抑制剂3-甲基嘌呤（3-methyladenine，3-MA）可抑制破骨细胞的分化成熟；骨保护素（osteoprotegerin，OPG）可诱导破骨细胞发生线粒体自噬，并抑制其骨吸收活性。说明自噬可能通过影响破骨细胞的分化成熟和活性来影响根尖周炎骨吸收。本文就缺氧对破骨细胞自噬的调控机制以及自噬对破骨细胞的影响机制做一综述。
    1.缺氧参与调控破骨细胞自噬的机制
    HIF是缺氧诱导的自噬信号通路中关键的转录因子，包括HIF-1α和HIF-1β。RAW264.7细胞中敲除HIF-1α后自噬和破骨细胞标志物显著下调。HIF-1α在常氧条件下（O2 > 21%）被蛋白酶体降解从而不能稳定存在，在乏氧条件下（O2 < 6%）可稳定表达并进入细胞核发挥作用。缺氧时，HIF-1α可上调BNIP3的表达，后者破坏Bcl2-Beclinl复合体，释放游离的Beclinl来形成VPS34-Beclinl复合体从而激活自噬。
    此外，Sun等研究发现，miRNA-20a可通过靶向结合自噬相关基因（autophagy related gene，ATG）16L1 的3′UTR 非编码区来下调自噬相关蛋白ATG16L1的表达，在缺氧条件下，HIF-1α与miRNA-20a结合可下调其转录水平，增加自噬相关蛋白的表达。缺氧通过HIF-1α调控破骨细胞前体细胞的自噬作用，当破骨细胞前体细胞的胞质内容物发生降解及结构调整后即形成破骨细胞。
    相关文献中提到，缺氧条件下HIF-1α可以刺激骨吸收相关细胞因子的表达，介导破骨细胞从有氧代谢逐渐变为无氧代谢以适应低氧环境。无氧代谢会产生更多的活性氧（reactive oxygen species，ROS），造成细胞损伤。为减少ROS的累积，HIF-1α通过诱导Bcl2/BNIP3 表达，启动线粒体自噬；同时HIF-1α增加糖酵解和线粒体的代谢率以产生足够的能量来支持缺氧条件下的骨吸收作用增加。缺氧相关的自噬可能在根尖周炎的发生和维持中有潜在的致病作用。
    Huang等研究发现，根尖周病变组织中的缺氧和自噬相关蛋白［Beclin1、p62和微管相关蛋白1轻链3Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3Ⅱ，LC3Ⅱ）除外］的表达显著高于正常组织，并且在透射电镜下观察到超微结构双膜自噬体和自噬溶酶体。Yan等研究显示，肿瘤坏死因子-α诱导蛋白3（A20）可促进人牙周膜细胞中肿瘤坏死因子受体相关分子6（tumor necrosis factor receptor- associated factor 6，TRAF6）的降解并抑制TRAF6的泛素化修饰，从而达到抑制自噬的效果，间接抑制破骨细胞的形成，进而控制根尖周炎骨吸收的进展。A20在根尖周炎缺氧环境下表达下降，与自噬通量呈负相关。
    2.自噬参与调控破骨细胞分化成熟和功能活性
    破骨细胞是多核巨细胞，具有骨质吸收的功能。自噬是真核细胞中维持自稳的高度保守的机制，其在应激状态下通过溶酶体途径清除细胞内受损或衰老的细胞器等物质，从而影响细胞生存、代谢及功能发挥，还能够诱发细胞自噬性死亡。自噬在正常细胞内长期维持在低水平稳定状态，但在应激条件下被大量激活，其活化过程涉及ATG3、ATG4、ATG5、ATG7、Beclin1、ATG16L1等自噬相关蛋白。
    越来越多的研究表明，自噬参与破骨细胞增殖、分化及功能活化，而破骨细胞的自噬活动发生异常可能会导致某些骨疾病如根尖周炎的发生。马金宝等研究发现，以LC3B为代表的自噬相关蛋白在人根尖周炎中的表达明显增多，同时可观察到炎症部位附近自噬水平上升，证明自噬作用可能与根尖周炎的发生有关联。
    2.1 自噬对破骨细胞分化成熟的影响
    巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulatingfactor，M-CSF）与核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）是两种重要的细胞因子，它们在诱导小鼠骨髓源巨噬细胞（bone marrow- derived macrophages，BMMs）分化为破骨细胞的过程中发挥着不可替代的作用。
    M-CSF能够促进造血干细胞分化为破骨细胞前体细胞，对破骨细胞的存活与增殖起着至关重要的作用；RANKL属于肿瘤坏死因子超家族成员，可与破骨细胞前体细胞分泌的RANK结合，并将信号传入破骨细胞前体细胞内，调节胞内转录因子的活化，使其向破骨细胞分化、成熟；并且破骨细胞在分化过程中会表达抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）和组织蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）。现有的研究显示，M-CSF、RANKL、TRAP和CTSK常被作为破骨细胞成熟分化的标志。
    ATG5、ATG7、ATG4B和LC3都是参与破骨细胞形成和骨吸收的重要基因，对破骨细胞相关因子具有一定的调控作用。ATG5和ATG7能够促进自噬和体内外的骨吸收活动，ATG7的下调可抑制破骨细胞标志分子TRAP和CTSK的表达，LC3被ATG4B修饰后阻碍CTSK的表达，这些现象均提示自噬参与了破骨细胞前体细胞的分化。
    有研究利用M-CSF 和RANKL 诱导RAW264.7 细胞分化为成熟的破骨细胞，观察分化过程中细胞自噬水平的变化，发现分化过程中自噬相关蛋白LC3表达水平增加，自噬水平升高，提示自噬参与M-CSF和RANKL介导的破骨细胞分化。也有研究表明，在破骨细胞前体细胞向破骨细胞分化的过程中，破骨细胞前体细胞的黏附和迁移是关键步骤。
    鞘磷脂衍生物溶血磷脂鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）是破骨细胞的趋化剂，S1P一方面可通过破骨细胞表达的相应受体S1PR来参与破骨细胞的迁移过程，另一方面可通过调节哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路抑制自噬并促进细胞凋亡，从而充当自噬和破骨细胞形成之间的纽带。由此可见，自噬的诱导可能是缺氧条件下破骨细胞分化的一个重要过程。
    2.2 自噬对破骨细胞活化的影响
    破骨细胞具有骨吸收活性，其在接触骨矿化表面时发生极化，胞膜向骨面突起而形成皱褶缘，继而肌动蛋白环封闭破骨细胞与骨面的外围接触点，溶酶体与皱褶缘相互融合并同时分泌酸和蛋白酶，使得骨基质脱矿并降解。研究发现，自噬所必需的蛋白质包括ATG5、ATG7、ATG4B 和LC3，在体内外对破骨细胞皱褶边缘的产生、破骨细胞的分泌功能和骨吸收具有重要作用。
    DeSelm 等的研究表明，自噬以及在皱褶边缘定向分泌溶酶体内容物均需要溶酶体融合到选定的膜上，而自噬蛋白则可调控吞噬体和溶酶体的结合。在此过程中，ATG5、ATG7和ATG4B系统产生的磷脂酰乙醇胺（PE）共轭LC3可标记暴露于细胞质的目标膜。因此，这些自噬蛋白可能通过将LC3定向到特定位置，阻止溶酶体非特异性融合到胞内膜，从而进一步促进破骨细胞的活化。
    DeSelm等建立了溶酶体中自噬基因ATG5 和ATG7 特异性敲除小鼠模型，发现ATG5在激活自噬作用的同时还会抑制褶皱缘的形成。ATG5和ATG7基因缺失的大鼠在破骨细胞形成过程中，破骨细胞的细胞膜上褶皱缘形态发生改变，降低了其骨吸收活性。
    此外，ATG5或ATG7基因缺陷都能抑制LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化，促进与分泌溶酶体的融合，从而促进细胞自噬的活化，并使破骨细胞介导的骨吸收能力下降。这些发现说明，破骨细胞褶皱缘的形成、破骨细胞分泌活性的维持和骨吸收的促进都需要自噬相关蛋白的参与，提示自噬可促进破骨细胞的形成和活化。综上所述，自噬影响破骨细胞活化的机制可能是，自噬蛋白通过引导溶酶体与质膜融合，参与溶酶体内容物向细胞外空间的极化分泌，从而促进破骨细胞的骨吸收活性。
    3.相关研究在防治根尖周炎骨吸收中应用现状
    Huang等发现，在根尖周炎患者的根尖囊肿和根尖肉芽肿等病变组织中，HIF-1α、BNIP3、pAMPK 三种缺氧相关蛋白和Beclin1、ATG5、ATG12等自噬相关蛋白表达明显高于正常牙髓组织。这说明根尖周炎时根尖周围组织处于低氧微环境中，提示病变部位存在广泛的缺氧应激介导的细胞自噬。这种缺氧相关自噬可能与根尖周炎中破骨细胞的活化和骨吸收有关，改善缺氧和自噬有望治疗根尖周炎骨吸收。
    目前根尖周炎的治疗方式主要为根管治疗，即清除感染坏死的牙髓组织，抑制根尖周围组织的炎症反应，最终使周围骨质得以自我修复。但通常受损骨质的修复需要6个月或更长时间，甚至有少数病例根尖瘘道长期不愈；或根尖炎症复发，根尖骨质进行性破坏，最终导致患牙脱落。因此，及时抑制根尖周炎骨吸收对根尖周病的治疗具有重要意义。
    3.1 低氧微环境的改善
    局部炎症导致缺氧，是根尖周炎病变的一大特征。改善低氧微环境不仅对厌氧菌生长有抑制作用，还能抑制破骨细胞的分化和功能，阻止患牙牙根周围骨质进一步吸收。Hadi等对受试者进行高压氧治疗，并在治疗前后分别从外周血中分离破骨细胞前体细胞，发现高压氧降低了破骨细胞前体细胞形成破骨细胞的能力，抑制了破骨细胞的骨吸收作用。
    Sinha等比较了不同的臭氧应用技术对根管治疗患者术后疼痛程度的影响，结果发现，与不使用臭氧治疗组相比，超声波和声波激活臭氧可以减轻患者根管治疗术后疼痛反应。研究表明，提高根尖周组织的氧含量、改善低氧微环境，对根尖周炎的预后具有积极作用。
    3.2 自噬抑制剂的应用
    自噬在破骨细胞分化中起着决定性作用，提示抑制自噬可作为治疗根尖周炎骨吸收的重要靶点。Xiu等发现，自噬抑制剂氯喹可抑制小鼠破骨细胞前体细胞自噬，在体外和体内实验中阻断破骨细胞形成，从而抑制骨吸收过程，有治疗骨质疏松的作用。He等研究了3-MA和氯喹两种经典的自噬抑制剂在大鼠根尖周炎和BMMs体外培养过程中的作用，发现3-MA和氯喹均可减弱自噬对破骨细胞的激活，对根尖周炎的骨吸收有预防和治疗潜力。
    此外，研究发现一些植物来源的药物可抑制破骨细胞自噬，表现出抑制破骨细胞分化的作用。例如，葛根素通过抑制破骨细胞前体细胞的自噬和增殖，抑制破骨细胞分化；石蒜碱可减少破骨细胞自噬，从而减少破骨细胞的数量和活性，发挥骨保护作用。这些自噬抑制剂为根尖周炎骨吸收的防治提供新的方法和手段。
    4.结语
    低氧微环境下自噬调控根尖周炎骨吸收的机制尚未完全明了。目前较为明确的是细胞在缺氧条件下上调HIF-1α表达，从而通过多条通路激活自噬相关因子表达，发生线粒体自噬。自噬可进一步调控破骨细胞分化成熟与活化，抑制自噬相关基因表达或使用自噬抑制剂可以阻碍破骨细胞分化。而自噬在破骨细胞分化和根尖周炎骨吸收中的调控作用及其分子机制尚不明确，有待进一步的研究。以破骨细胞自噬为靶点，筛选和确定能治疗根尖周炎骨吸收的药物，为促进根尖周骨再生和患牙保留提供支持。