口腔微生态与龋病防治的研究进展

    龋病是指发生于牙体硬组织的慢性进行性疾病。世界卫生组织将龋病与肿瘤、心血管疾病并列为人类三大重点防治疾病。第四次中国口腔健康流行病学调查报告显示，儿童乳牙和成人恒牙患龋发生率均呈上升趋势。随着现代口腔微生态学的发展及研究方法的进步，人们逐渐认识到龋病的发生与口腔微生态失衡密切相关，并通过调节口腔微生态来防治龋病。本文对口腔微生态与龋病防治的研究进展进行了综述。
    1.口腔微生态概述
    口腔微生态是由口腔内存在的各种微生物及唾液等环境所构成的微生态系统，在参与机体代谢、免疫、营养及维持口腔健康等方面具有重要生理作用。目前研究发现，人类口腔内至少包含179属645种微生物，虽然大部分微生物无法进行体外培养，但随着16srRNA基因测序技术和宏基因组学的发展，逐渐丰富了人们对口腔微生态的认识。
    利用宏基因组测序方法分析口腔细菌菌群结构时发现，口腔内优势菌属包括奈瑟菌属、罗斯菌属、链球菌属、韦荣菌属、放线菌属等多个菌属。这些菌属存在形式大多为生物膜，而生物膜是维持口腔微生态平衡的重要屏障之一，因此抗致病性生物膜的方法被广泛应用于口腔疾病的防治。
    有研究发现，口腔微生态的改变与多种口腔疾病相关，如龋病、牙髓炎、牙周炎，甚至口腔颌面部肿瘤等。如口腔内微生物通过激活Toll样受体，触发一系列促炎途径的信号通路，释放有害代谢产物如过氧化氢，形成促癌生长的环境，从而诱导口腔癌的发生。有研究应用同位素标记相对和绝对定量技术在龋活性样品中检测到放线菌、链球菌等细菌。
    2.口腔微生态失衡与龋病的发生发展
    口腔在受到外界刺激或口腔内环境改变时，口腔微生物群的种类、结构会发生变化，物质的代谢也会受到影响，出现口腔微生态失衡，导致疾病的发生、发展。龋病是在含糖食物持续刺激下，口腔内菌群比例失调造成生物膜内pH 值下降致牙齿脱矿而形成。
    有研究发现，龋病人群微生物群落结构、组成及代谢较健康人群更为复杂，其中链球菌属、放线菌属、乳杆菌属、韦荣球菌属、艰难杆菌属等多种细菌菌属的丰度相对较高，且在龋病治疗后，口腔微生态失衡会得到一定改善，提示口腔微生态失衡在龋病的发生和发展中具有重要作用。
    2.1 链球菌属与龋病
    链球菌属是口腔微生态的重要组成部分，在健康人群和龋病人群口腔中为优势菌属，其中变异链球菌与龋病的相关性最大。变异链球菌成功黏附于牙面是其致龋的首要条件，其可分为蔗糖依赖性黏附和蔗糖非依赖性黏附。蔗糖依赖性黏附指在葡糖基转移酶（GTFs）作用下，变异链球菌代谢蔗糖产生葡聚糖，并与特异性受体—葡聚糖结合蛋白结合，进而介导细菌与牙面之间的黏附。
    蔗糖非依赖性黏附是变异链球菌借助srtA酶和细胞表面蛋白与唾液糖蛋白的相互作用黏附于牙面。黏附后，变异链球菌代谢糖类产生胞外多糖，形成酸性终末产物，并在酸性条件下生存且不断产酸，导致龋病发生、发展。有研究表明，vick、srtA、rnc、luxS等基因参与调控变异链球菌生物膜形成、牙面黏附及产酸耐酸能力。如对变异链球菌生长和毒力进行抑制，其数量与龋病损害程度呈负相关。其他链球菌也可能通过产生过氧化氢等有害代谢产物对口腔致龋菌产生拮抗，具有一定的防龋作用。
    2.2 放线菌属与龋病
    放线菌作为一种不具动力、无芽孢形成的微生物，可分为兼性厌氧菌及厌氧菌两类，其形成生物膜能力强，在龋病发展过程中具有重要作用。放线菌与老年人根面龋关系密切。在无病原菌的啮齿动物中接种放线菌，可诱发根面龋。根面龋的病变与多种微生物有关，虽然各个研究之间检测到的微生物量不一样，但一致认为放线菌、变链菌、乳杆菌为其优势菌群。
    在轻度的酸性条件下，放线菌的菌落位于菌斑生物膜最里层，可能通过酸碱度的调节机制对牙齿的脱矿与再矿化发挥作用。此外，SHEN等研究发现，放线菌与韦荣氏球菌、普氏菌、梭杆菌之间存在显著的细菌共聚集反应，不同菌种之间可形成更紧密联系，以利于牙菌斑的形成，从而致龋。
    2.3 乳杆菌属与龋病
    唾液中的乳酸杆菌计数高被认为是龋齿的决定性因素，但乳杆菌属中某些菌种却具有预防龋病的作用。因此，在考虑乳杆菌属与龋病相关性时，应考虑其双重性，综合考虑菌种类型。干酪乳杆菌是造成龋病的重要微生物群落之一，与停滞的牙本质病变相比，副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌组物种在活动性牙本质病变中表达较丰富。
    在可逆性牙髓炎到不可逆性牙髓炎的深龋中，乳杆菌属相对丰度也是最高的，提示乳杆菌属在龋病发展过程中起重要作用。有研究发现，植物乳杆菌FB-T9在平板竞争试验中表现出良好的抑菌能力，可明显降低变形链球菌生物膜的生物量和生存能力，降低大鼠龋齿中变形链球菌水平及龋齿评分（改良的Keyes评分），并在口腔中具有很大的定殖潜力。
    2.4 韦荣球菌属与龋病
    韦荣氏菌是一种革兰阴性专性厌氧菌，可代谢短链有机酸，曾被认为是有效改善pH 值降低的防龋益生菌。多种研究表明，龋病组及无龋组韦荣球菌检出率有显著差异，其主要致龋作用表现在对链球菌属致龋的协同作用上。在生物膜形成过程中，殊异韦荣菌的形态和存在形式可由分散单一演变为被细胞间桥相连接的大扁圆结构，该结构可在一定程度上加强细菌生物膜的稳固性。
    变链菌和韦荣菌双菌种生物模型研究证实，韦荣球菌能促进一系列链球菌的生物膜形成。韦荣球菌的另一协助致龋作用是在一定程度上可抑制变形链球菌的竞争抑制菌。戈登链球菌能通过产生过氧化氢来对变形链球菌的生长进行抑制，而小韦荣菌的过氧化氢酶基因产物能在一定程度上改善过氧化氢环境对变形链球菌及具核梭杆菌生长的抑制。
    2.5 细胞外基质与龋病
    口腔微生态中除口腔微生物与龋病密切相关外，细胞外基质在龋病的发生和发展中也具有重要作用。细胞外基质由口腔内多种微生物产生，主要成分是胞外多糖（EPS），如葡聚糖、果聚糖等。细胞外基质经组装形成复杂的生化微环境和空间微生物异质性的限制扩散的三维支架，有助于细菌定植并提供保护，从而促进生物膜的生长及成熟。
    同时，EPS可作为内源性糖来源，帮助生物膜内细菌代谢产酸，且可限制唾液进入，有利于致龋微环境的形成，从而增强酸对釉质的作用及引发龋病的能力。生物膜内pH 值随酸的增加不断下降，产酸且耐酸的致龋细菌如变形链球菌、乳酸杆菌等逐渐占生长优势，导致口腔微生物群失调使牙界面持续酸化，进而导致牙釉质脱矿，引起龋病。
    3.口腔微生态的调节与龋病的防治
    口腔微生态的失衡可导致龋病发生、发展。目前临床研究发现，可通过多种机制调节口腔微生态的平衡达到防龋目的，如精氨酸、益生菌和抗菌肽等均可拮抗口腔微生态中致龋生物膜的形成，具有良好的防龋潜力。
    3.1 精氨酸
    最近的研究表明，精氨酸对口腔细菌的生长、代谢及生物膜的形成具有重要作用，其代谢可通过精氨酸脱亚胺酶途径（ADS）产生氨形式的碱，对维持生物膜内pH 平衡有极大影响，有利于调节口腔微生态，可能成为一类有前途的抗龋剂。
    HUANG等的研究结果显示，在精氨酸存在下的生物膜中EPS/细菌比率较无精氨酸存在时降低，且水溶性EPS的产生显著降低，提示精氨酸可抑制EPS的形成，具有良好的防龋潜力。ZHENG等通过临床队列和唾液衍生的生物膜模型研究发现，精氨酸治疗可通过富集产碱细菌和抑制产酸物种来调节口腔微生物群，影响口腔菌群酸碱代谢相关基因的酶活性及表达，如上调有龋活性个体的ADS活性。另外，使用含精氨酸的漱口水或其他可增强精氨酸的有效性的方法可提高ADS活性，加快细菌产碱代谢，对抗酸性生物膜，改善pH 稳态，预防龋病进一步发生、发展。
    3.2 益生菌与抗菌肽
    益生菌和抗菌肽可通过拮抗龋相关细菌影响致龋生物膜的形成来改善口腔微生态失衡，在龋病防治中具有良好的应用前景。除了使用精氨酸及具有高ADS表达特性的菌株作为益生菌外，血链球菌因其定植高效、致龋潜能低、可拮抗致龋物种等优势，曾被视为理想的口服益生菌，但其易受各种环境影响，且不适用于患心脏瓣膜缺陷的人群。
    有研究发现，植物乳杆菌108可明显抑制浮游变形链球菌的生长及变形链球菌生物膜的初始定植和预形成，是一种有潜力的益生菌。抗菌肽是一类具有抗菌活性的碱性多肽物质，唾液和龈沟液中天然抗菌肽的防御能力不足以对抗口腔细菌，且易发生降解，抗菌肽仿制品或一些新型小分子抗菌剂可提高抗菌活性和稳定性。
    JIANG等采用可控的多物种生物膜模型证实，抗菌肽GH12在浓度不大于8mg/L时可选择性抑制变形链球菌，并可改变生物膜中的微生物组成。体外实验也表明，GH12可降低变形链球菌生物膜形成，减少产酸及EPS的合成。
    3.3 纳米材料与小分子物质
    随着纳米技术的不断发展，纳米材料在龋病的治疗中被广泛应用。有研究发现，有机纳米粒子可减少牙齿脱矿及促进再矿化，加入无机抗菌纳米离子的修复材料具有较高的抗菌活性且可维持长期抗菌性能。氟化物是临床常用防龋药物之一。有研究显示，含氟银纳米粒子对变形链球菌具有良好的抗菌效果，且不染色、不致龋，具有成为防龋剂的潜力。
    羟基磷灰石（HA）在牙科修复中占据重要地位，纳米HA可在一定程度上抑制牙齿脱矿，分解的纳米HA可通过抑制口腔细菌的生长代谢来调节口腔微生态，且不影响多物种生物膜的组成，有益于龋病的防治。新型小分子ZY354（吲哚啉-2-1和硝基呋喃的杂化产物）在体外对口腔链球菌显示出强大的抗菌活性，且对人类口腔细胞表现为较低的细胞毒性，在口腔抗菌剂的应用方面具有很大潜力。
    4.中医药在调节口腔微生态、防治龋病中的应用
    中医药调节口腔微生态的作用是近年来研究热点之一，因其资源丰富、安全性好、不良反应少，被广泛研究应用于口腔疾病的防治。一些天然中药活性提取物可通过抑制致龋微生物生长及其生物膜形成、抑制GTFs基因等途径调控口腔微生态平衡。LI等利用体外生物膜模型研究发现，姜黄素可通过抑制GTFs基因、减少EPS的产生及拮抗变形链球菌生物膜生长代谢来影响口腔微生态，从而达到防龋效果。有研究发现，红景天提取物可抑制变形链球菌生物膜形成及EPS合成，以及一些毒力基因的表达，有希望作为龋病的辅助或替代疗法。
    5.小结
    人们对龋病的病因学认识由特定致龋菌逐渐向口腔微生态失衡转变。口腔微生态失衡会影响龋病的发生、发展，精氨酸、益生菌等可调节口腔微生态，被认为是可防治龋病的重要手段。由于口腔内环境的复杂性及特殊性，未来应考虑益生菌是否耐受口腔生存环境、药物在口腔内的生物活性等问题，以及这些防龋措施的生物安全性和可行性。另外，中草药及其提取物因其来源广泛、作用温和，可用于调节口腔微生态，进而防治龋病，值得进一步研究。