牙周炎与不良妊娠结局相关关系的研究进展

    正常妊娠时，胚胎胚膜和子宫内膜逐渐形成胎盘，为母亲和胎儿之间进行营养和废物交换提供基础。正常分娩是由肿瘤坏死因子α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）等作为主要的信号网络，刺激其他效应分子如前列腺素（prostaglandin，PG）和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）等表达，以及进一步趋化细胞因子产生，这些效应共同形成了一个放大的级联机制，造成生殖组织一系列信号分子的协调激活，进而导致正常的足月分娩。
    妊娠期间的任何病理情况（如感染、炎症等）可能刺激其中一条或全部途径，导致子宫组织中信号通路的异常激活，从而影响妊娠结局。不良妊娠结局（adverse pregnancy outcomes，APO）是指妊娠后不能产生外观和功能正常的子代，包括早产（妊娠达28周但不足37周分娩者）、低出生体重（新生儿出生体重小于2500g者）、子痫前期（子痫前期是一种并发症，其特征是在怀孕20周后发生在孕妇身上的高血压和肝或肾损害的迹象）等。
    近年来，APO发生呈上升趋势，其中早产在发达国家发生率为6%～11%，我国为7%～15%，是导致围产儿以及5岁以下儿童死亡的主要原因。各种APO给社会和家庭带来了巨大负担，已成为一个严重的公共卫生问题。早期研究表明，吸烟、营养不良、不健康的生活方式等都是APO的危险因素，近年来局部和全身炎症免疫反应与APO的关系受到广泛关注。
    牙周炎（periodontitis）是由菌斑微生物引起的慢性炎症性疾病。牙周致病菌及其代谢物进入血循环，引发宿主免疫炎症反应，与各种全身性疾病密切相关，同时也影响妊娠结局。因此，本综述主要对牙周炎和APO相关关系进行概括，并进一步从阴道感染、菌血症、免疫炎症和肠道菌群方面对其机制进行初步探讨。
    1.牙周炎与APO相关的证据
    1996年Offenbacher等研究发现患有牙周病孕妇的早产概率是牙周健康孕妇的7.5倍，提出“牙周感染是低出生体重儿的危险因素”，第一次将牙周病与APO联系起来。之后，很多学者做了二者相关性的研究，证据主要集中于以下四个方面。
    1.1流行病学研究
    Figueiredo等进行回顾性队列研究发现重度牙周炎的孕妇比牙周健康的孕妇发生胎膜早破的风险高（OR=5.59，P=0.017），其相对应的新生儿生长受限的风险是正常的11.53倍（OR=11.53，P=0.041）。此外，有横断面研究发现母体牙周病与早产（aOR=2.32；95%CI：1.33～4.27）、低出生体重（aOR=2.41；95%CI：1.34～4.33）、子痫前期（aOR=4.12；95%CI：2.20～7.90）显著相关。
    国内学者进行病例对照研究发现孕妇牙周病与早产呈正相关（r=0.726，P=0.001）。2019年一项共识报告指出，牙周炎导致早产的危险度（OR=2，95%CI：1.2～3.2）甚至大于吸烟导致早产的危险度（OR=1.7，95%CI：1.3～2.2）。以上研究说明至少在某些人群中，牙周感染会增加APO的风险。
    1.2组织学研究（牙周致病菌的检出）
    胎盘、胎儿、脐带血等胎儿组织中有口腔微生物的检出是评估胎儿－胎盘结构中有口腔感染性的最有力证据。Vanterpool等采用免疫荧光组织学方法发现在早产儿队列中，97个胎盘标本中有49个（51%）牙龈卟啉单胞菌（porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）阳性，并且P.gingivalis阳性胎盘的比例在妊娠27周时最高（78%），之后随着胎龄的增加阳性率逐渐降低（OR=0.63，95%CI：0.48～0.85；P=0.002），提示胎龄缩短（即早产）与胎盘P.gingivalis阳性检出率成正相关。97个脐带标本中有40个（41%）P.gingivalis阳性，子痫前期与脐带中P.gingivalis的阳性检出显著相关（OR=6.73，95%CI：1.31～36.67；P=0.02）。
    具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum，F.nucleatum）也是常见的牙周致病菌，常与APO相关。在正常阴道菌群中不存在，是宫内感染常见的菌种之一，与10%～30%的早产相关。有临床研究采用TaqMan探针实时定量PCR检测28例早产孕妇和36例健康孕妇胎盘组织中，伴放线聚集杆菌、P.gingivalis、福赛坦氏菌、齿垢密螺旋体、F.nucleatum和中间普氏菌的含量，发现6种牙周病原菌均可在胎盘标本中检出。
    而早产组胎盘标本中F.nucleatum的检出率要高于健康组（78.6%vs.61.1%，P=0.0062），且Logistic回归分析显示胎盘中的F.nucleatum与早产显著相关（OR=3.3，95%CI：1.1～10.6；P＜0.05）。
    1.3动物实验研究
    Ebersole等的研究描述了怀孕的狒狒自发性流产/死胎发生率在牙周炎组（8.7%）高于对照组（3.8%）（P=0.054），发现狒狒妊娠期患牙周炎时增加APO风险的可能性超过2.8倍。在有牙周炎且发生胎盘早剥的小鼠胎盘中，使用巢式PCR证实存在编码P.gingivalis特异性酶的mdl基因。Phillips等研究也发现经口腔感染A7436P.gingivalis菌株的孕鼠胎盘螺旋动脉重构受损，胚胎死亡增加，提示P.gingivalis可能损伤胎盘且影响妊娠结局。
    1.4干预研究
    Polyzos等对7项随机临床试验的Meta分析发现孕期牙周治疗可显著降低早产的发生率（OR=0.55；95%CI：0.35～0.86；P＜0.05），同时有5项研究显示低出生体重儿的发生率显著降低（OR=0.48，95%CI：0.23～1.00；P＜0.05）。
    近期，一项Meta分析也得出了相似的结论，孕期牙周治疗可降低早产风险（n=7335；RR=0.78（0.62～0.98）；P=0.03），且可以显著增加新生儿体重，平均增加200g（n=4708；MD=200.79（63.34～337.24）；P=0.004）。
    以上证据均表明牙周炎与APO存在相关性。妊娠期间孕妇的牙周治疗是安全的，且有利于孕妇的牙周健康以及全身健康，有利于减少母体向胎儿的细菌传播，减少多种并发症的发生，这是双向受益的。所以在孕前及孕期保持良好的口腔卫生，定期接受牙周检查及治疗，是预防妊娠期牙周病及APO的有效途径。
    2.牙周炎与APO相关机制的研究
    母体患牙周炎时，牙周致病菌通过阴道上升造成宫内感染，同时参与阴道感染、引发低水平菌血症、改变机体炎症免疫反应及诱发肠道菌群失调等使机体处于慢性炎症状态，进而影响妊娠结局。
    2.1P.gingivalis及其他牙周致病菌可能参与阴道感染
    口腔内的微生物可以通过胃肠道或者性行为传播到女性宿主的阴道内，如P.gingivalis可以通过阴道上行到达胎盘单位，造成宫内感染，改变母体炎症免疫反应来影响妊娠。同时，研究发现P.gingivalis可能也会参与阴道感染，导致宫颈和阴道液中IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α，PGE2等炎症因子浓度增加，进而刺激子宫肌层，导致子宫收缩力增加，进而诱发早产和胎膜早破。
    此外，其他的牙周致病菌也被发现通过诱导阴道菌群失调来影响妊娠结局，如F.nucleatum也是口腔中与牙周病相关的微生物，体外、动物和临床研究均表明F.nucleatum可以通过增强与阴道细菌生态失调有关的唾液酸酶活性定植于阴道中，促进了阴道菌群失调，同时高的唾液酸酶活性又与早产风险增加有关。阴道菌群失调还会破坏阴道表面的物理－免疫屏障，改变阴道pH，在妊娠时引起绒毛膜羊膜炎症，从而导致胎膜早破、早产、流产等APO。
    2.2菌血症
    牙周致病菌通过菌血症定植到胎盘，损伤胎盘相关组织如滋养层细胞。滋养层细胞在形成胎盘组织和重塑子宫螺旋动脉中是必不可少的，其坏死、凋亡和功能发生改变，可能导致胎盘床缺陷、螺旋动脉错误重构、胎盘血流阻力增加等，从而影响母体与胎儿之间的血供导致APO发生。研究发现P.gingivalis通过诱导滋养层细胞凋亡参与APO的发生可能与Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）、Fas和FasL、细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2）和P38丝裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）的激活有关。
    TLR是激活由病原菌感染诱导的免疫反应信号通路的受体，可识别微生物结构如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）；Fas是激活外部凋亡通路的受体，和FasL之间的相互作用是细胞凋亡的主要信号通路之一。ERK1/2是一种促生存因子，参与调节细胞增殖和分化，但在炎性因子、缺氧、遗传毒性刺激或氧化应激之后，可能导致细胞周期停滞或凋亡；p38MAPK也可参与细胞凋亡。
    2018年杜名权教授的团队研究发现P.gingivalis感染的孕鼠可引起新生鼠低出生体重，激活胎盘组织TLR4、Fas/FasL表达增强，提示罹患牙周病的孕妇娩出低体重儿，可能与P.gingivalis激活的胎盘组织的TLR4和Fas/FasL异常调节有关。
    另有动物研究发现P.gingivalis感染后，小鼠胎盘TLR2表达同样升高，诱导胎儿－胎盘界面发生炎症以及滋养层细胞凋亡，从而导致早产、低出生体重等。体外研究发现，P.gingivalis可以通过激活ERK1/2和p38信号通路诱导滋养层细胞的凋亡。因此，P.gingivalis定植胎盘后可能通过激活ERK1/2，p38，TLR2/4，Fas/FasL信号通路来诱导滋养层细胞凋亡，进而影响妊娠结局。
    2.3炎症免疫反应
    机体局部有炎症会启动宿主免疫系统，可能会杀灭微生物，但是对其释放的炎性介质并没那么容易清除。牙周炎患者因局部牙周袋内长期存在低度感染和炎性介质可能会对妊娠产生影响。
    2.3.1炎症反应
    ①局部组织破坏：当P.gingivalis进入母体组织后，LPS与母胎组织中的TLR、补体受体、核苷酸结合寡聚域（NOD）结合，增加中性粒细胞的浸润，进而释放MMPs，损伤宫腔结缔组织，导致子宫腔的胶原降解，使绒毛膜和羊膜破裂，羊水渗漏，从而发生胎膜早破。
    ②循环中炎症因子水平升高：动物研究表明，P.gingivalis感染可在小鼠母体和胎儿循环中上调多种细胞因子，如IL-6（2倍）、IL-17（2倍）、IL-1β（2倍）、TNF-α（2.5倍），进而在子宫肌层中产生PGE2，子宫肌细胞内钙的流入增多，促进子宫肌层收缩，增加早产和复发性流产的风险。
    炎症因子也与血清铁降低有关。体外肝细胞培养中发现IL-6能诱导铁调素高表达。铁调素通过降解膜铁转运蛋白（ferroportin，Fpn）来阻碍铁的吸收、循环和动员，降低血清铁水平。动物研究发现，在妊娠小鼠体内注射LPS会导致铁调素升高大于20倍，并伴有严重的低铁血症，胚胎的死亡率达到了40%，说明铁调素介导的母体血清铁降低会导致APO。因此推测牙周炎时IL-6，LPS的升高，引起母体血清铁水平降低，可能也会影响妊娠结局。
    ③氧化应激反应：P.gingivalis通过激活中性粒细胞和巨噬细胞介导的吞噬作用，释放大量活性氧（ROS），增加氧化应激反应。从而导致细胞DNA、脂质、蛋白质损伤，合胞体滋养层细胞空泡性变、表面微绒毛减少，造成胎盘绒毛膜炎，诱发许多妊娠并发症，如先兆子痫、胎儿生长受限、早产等。ROS甚至可以影响胎盘中白细胞的端粒长度，加速白细胞衰老进而诱导胎膜破裂。
    ④母体肝脏急性期反应：C反应蛋白（CRP）代表了急性期反应时参与的蛋白，与牙周炎的活动期有关。细菌和促炎因子从感染的牙周组织释放到体循环也可能通过肝脏的急性期反应引发母体低度全身炎症，表现为CRP和纤维蛋白原的产生和释放增加，进而放大胎盘界面的炎症反应；羊水中CRP水平的增加使羊膜腔内压升高并引起子宫肌层收缩，最终可能造成子宫内膜动脉炎、先兆子痫、胎膜早破等。
    2.3.2免疫反应
    ①Treg/Th17比例失衡：动物研究发现，P.gingivalis会引起母体颈淋巴结中Th17细胞增多，抑制Treg细胞，进而增加体循环中IL-17的水平。IL-17升高与凝血机制改变、母体血液循环受损、胎儿和母体组织缺氧等有关，增加APO发生的风险。同时，Pongcharoen等体外研究发现，IL-17增多可能也会上调JEG-3胎盘绒毛膜癌细胞系的侵袭能力，并显著增加分娩过程中黄体酮的分泌，影响子宫螺旋动脉的重塑以及滋养层细胞迁移等，这与怀孕期间动脉粥样硬化、胎儿生长受限和子痫前期的发生有关。
    ②中性粒细胞增多：近期研究发现，激活的中性粒细胞将其DNA和细胞内容物排出形成一个网状结构，称为中性粒细胞胞外陷阱（NET）。NET通过建立炎性微环境，与多种炎症性疾病以及肿瘤的发展有关。Sun等临床研究发现，即使是未患妊娠期糖尿病的孕妇，中性粒细胞计数（OR=3.66；95%CI：1.78～7.56，P＜0.001）仍是妊娠期糖尿病的独立危险因素，提示妊娠早期中性粒细胞计数和NET可能与妊娠期糖尿病的发生和APO密切相关。孕妇患牙周炎时，P.gingivalis激活的中性粒细胞可能也会通过上述过程影响妊娠结局。
    ③诱导抗心磷脂抗体产生：滋养层细胞上有一种细胞内磷脂结合蛋白－膜联蛋白V，它与暴露的磷脂阴离子结合并在细胞表面组装成二维晶格，形成一种保护性屏障，可以防止纤维蛋白凝块的形成。有研究发现牙周炎妊娠小鼠模型中P.gingivalis会诱导产生一种抗心磷脂抗体（IgG anticardiolipin，IgGaCL），该抗体可以与膜联蛋白V竞争磷脂阴离子，破坏膜联蛋白V在滋养层细胞上形成的保护屏障，促进纤维蛋白血凝块的形成，促进凝血，从而可能参与APO的发生。
    2.4P.gingivalis通过改变肠道菌群影响妊娠结局
    口腔细菌通过吞咽等进入肠道，会造成肠道菌群变化，肠道菌群改变可影响机体炎症免疫反应，对于妊娠期女性，该种变化可能会影响妊娠结局。在小鼠模型中，口服P.gingivalis改变了肠道上皮细胞屏障功能，诱导肠道微生物区系组成的变化（类杆菌门增加，牙龈假单胞菌门减少）。
    肠道菌群失调可使机体Th1/Th2及Treg/Th17比例失衡；过度增加的LPS可与肠道上皮中的TLR4和TLR2结合，同时激活Kappa-B，使细胞合成并释放TNF-α、IL-1和IL-6等炎性因子，导致机体出现代谢性内毒素血症及全身炎症反应；以及通过氧化应激反应等参与子痫前期等的发生。P.gingivalis虽可改变肠道菌群，但其如何造成肠道菌群失调，损害肠道屏障功能的具体机制仍有待研究。
    3.牙周炎与APO共有的遗传背景
    早产、低出生体重、流产等众多APO有一个炎症基础，牙周炎和细菌性阴道炎甚至炎症性肠病等都涉及到炎症免疫反应，而与炎症通路相关的基因变异会增加对这些疾病的易感性。其中如TLR受体的激活等可能导致如rs2234663基因内含子的突变，TNF-α可能导致rs1800629基因中SNP转录增加等，这些基因突变强化了早产与免疫炎症性疾病之间存在共同遗传背景的假设，但是也受到种族、环境等的影响，因此具体的关联与影响还未知。
    4.总结与展望
    综上所述，牙周炎与APO密切相关。牙周致病菌可通过参与阴道感染，造成阴道菌群失调影响妊娠结局；诱发低水平菌血症影响滋养层细胞对胎盘产生直接损伤；通过增加母体和胎儿循环中炎症因子以及ROS水平，诱导母体肝脏急性期反应，改变宿主局部和全身炎症免疫反应；以及通过改变肠道菌群来影响妊娠结局，同时牙周病与APO可能是拥有共同宿主易感的遗传背景而产生联系。
    但上述证据很多为动物研究，且两种疾病之间相互混杂因素不可控制，因此还无确切的证据表明牙周炎是APO的危险因素，所以需要大量的分子、动物和临床研究来解释牙周炎与APO之间确切的发病机制，从而为临床孕妇牙周病和APO的预防提供更具体的指导。