牙髓再生技术应用于成熟恒牙的挑战及应对策略

    成熟恒牙指萌出后到达牙合平面，形态和结构发育成熟及根尖孔闭合的恒牙。牙髓炎及根尖周炎是常见的口腔疾病，对于患有牙髓炎及根尖周炎的成熟恒牙，首选方案是根管治疗。但根管治疗后的牙齿缺乏血液供应及神经支配，无法抵御外界感染;根管治疗也难以彻底清除复杂根管系统内的感染及严格封闭根管系统，且会导致牙体应力降低，增加根折的风险。
    牙髓再生是近年兴起的一种牙髓治疗手段。美国牙髓病协会将其定义为：通过生物学手段和组织学工程修复根管系统，使牙髓损伤坏死而牙根尚未发育完成的年轻恒牙实现牙髓组织和受损牙体组织的再生，牙髓生理功能的恢复，牙根的继续发育。该定义将牙髓再生的应用局限于未成熟的年轻恒牙，而临床上接受根管治疗的成熟恒牙远多于年轻恒牙，成熟恒牙的牙髓再生具有巨大的应用前景。近年来涌现出大量报道了成熟恒牙成功实现牙髓再生的病例报告，在这些病例中，根管系统内形成了血流及对刺激的敏感性。
    2019年的一项针对成熟恒牙牙髓再生效果的随机临床对照研究显示，对成熟恒牙行牙髓再生的成功率可高达92.3%，与行根管治疗的对照组成功率无明显差异，可见成熟恒牙具有成功实现牙髓再生的潜力。目前牙髓再生有两种策略。一种是内源性干细胞归巢技术：内源性干细胞在多种因素作用下迁移至靶组织定植存活并发挥功能。
    通过根管锉刺激根尖引血，动员细胞因子，从受损部位募集内源性干细胞，诱导修复或替换受损的细胞组织。这种方法操作简单，但其再生和修复能力有限，无法控制根管中再生组织的类型，需要进一步改进，比如添加细胞因子或精确的支架来调节根管中血管系统及硬组织的形成。另一种是外源性干细胞移植：将外源性支架和干细胞移植到所需位点以实现牙髓组织的再生。
    对于成熟恒牙，在牙髓再生的实践中有其困难之处。本文对成熟恒牙在牙髓再生中的根管预备、根管感染控制、干细胞来源及生长因子与支架的应用面临的困难及应对策略作一综述。
    1.根管预备中的挑战
    牙髓再生中应避免对根管壁进行机械预备，仅使用合适的器械去除松散或坏死的牙髓组织。根尖直径是牙髓成功再生的重要因素，根尖直径在0.5~1 mm 的牙行牙髓再生治疗的成功率最高，若患牙根尖孔太小，不仅影响内源性干细胞归巢，还影响再生过程中新血管的形成及神经的长入。成熟恒牙的根尖孔已发育完毕，根尖孔直径为0.2~0.68 mm，大多数成熟恒牙根尖孔直径在0.5 mm 以下，是进行牙髓再生的难点。可以考虑对成熟恒牙的根尖孔进行适当的预备以解决此问题。
    一篇病例报告曾报道，对2例根尖孔较小的成熟恒牙，以逐步后退法扩大根尖孔直径至0.6 mm 后行常规牙髓再生治疗程序，均取得了成功。对成熟恒牙行根尖预备不宜过大，工作宽度超过1 mm 会增加根折的风险或造成根尖外伤，破坏根尖区的干细胞及分泌生长因子的组织。年轻恒牙较成熟恒牙牙髓再生的成功率高的一个重要原因是年轻恒牙的根尖直径比成熟恒牙大，有利于干细胞的归巢及血管的长入。
    2.根管感染控制策略
    根管内感染的有效控制是牙髓再生治疗技术成功的关键。外界微生物及其毒素侵入牙髓组织引起的炎症反应会损伤干细胞，增加失败的风险。如果将消毒后的根管中残留细菌量降低到引起病变的阈值之下，则牙髓再生后的根管中的病变就会逐渐恢复，且再生组织中的免疫细胞可有效发挥抵御感染功能。年轻恒牙根尖尚未发育完全，根尖解剖较为简单，根尖孔大，血运丰富，具有较强的愈合能力和对牙髓疾病的抵抗力。
    而成熟恒牙根尖发育完毕，根管解剖结构复杂，在牙髓再生技术中不可进行充分的根管预备，难以清理根尖区域以控制感染，但并非不能实现。对于根尖大面积病损的患牙、甚至再治疗的患牙，都有通过有效的感染控制手段，如大量化学冲洗，以实现成功的牙髓再生的先例。具有高效的杀菌效果和组织溶解能力的次氯酸钠是常用的根管冲洗液，也是欧洲牙髓病学会和美国牙髓病学会推荐用于牙髓再生治疗技术中的消毒剂。
    较常规的根管治疗及活髓保存术，在牙髓再生技术中使用次氯酸钠更应注意对浓度的控制。因为高浓度的次氯酸钠会改变根管内微环境，降低干细胞的存活率和粘附率。欧洲及美国牙髓病学会建议使用1.5%~3%浓度的次氯酸钠，且在次氯酸钠冲洗后应用生理盐水反复冲洗以降低次氯酸钠残留。另一种常见的根管冲洗液是EDTA，可以螯合钙离子，有助于次氯酸钠渗透到牙本质小管中。它对于干细胞的活力影响很小，还可以逆转次氯酸钠对干细胞的损伤。这是因为牙本质中含有大量有益于干细胞趋化、粘附、存活和分化的细胞因子，而EDTA可以通过处理牙本质表面促进这些细胞因子的释放，暴露细胞外基质便于细胞粘附，为干细胞发挥作用提供理想的微环境。
    其他改善根尖复杂解剖区清理效果的消毒手段还包括联合应用负压冲洗系统、超声荡洗，激光激活活性氧的光动力疗法等。目前常用于牙髓再生治疗的抗菌药物是三联抗生素糊剂（TAP：环丙沙星、米诺环素、甲硝唑）及双抗生素糊剂（DAP：环丙沙星、甲硝唑），它们可以有效消毒根管系统。但抗生素对干细胞具有一定的毒性，会抑制牙本质中生长因子的释放。其毒性效果与其组成成分、药物浓度、作用时间和载体有关。
    环丙沙星及米诺环素为酸性，不利于干细胞生长和增殖，术者可以考虑通过调节TAP的pH 使其接近中性以保护干细胞。抗生素浓度<1 mg/mL 时不影响干细胞的存活，但低浓度的抗生素难以达到需要的抗菌效果。
    有学者将低浓度抗生素放入纳米纤维中，作为三维管状药物递送系统放入死髓牙的根管系统中。在感染根管中，这些纳米纤维缓慢长期释放药物清除感染，且不会对干细胞造成损伤，从而创造出有利于组织再生的无菌环境。也有学者探索更好的可用于牙髓再生的抗生素药物：克林霉素。它具有显著的抗菌作用，生物相容性也更好，并且具有促血管生成活性，可以成为米诺环素的良好替代品。
    3.干细胞来源
    细胞归巢技术应用于成熟恒牙牙髓再生面临的主要障碍是内源性细胞的缺乏。牙髓再生的干细胞来源可能为牙髓干细胞、根尖乳头干细胞、牙周膜干细胞、牙槽骨干细胞等。年轻恒牙根尖尚未发育完全，牙乳头中存在大量根尖周牙乳头干细胞（SCAP），它具有自我更新能力及高度可塑性，可在体内分化为成牙本质细胞，是牙髓再生的有效细胞来源。
    成熟恒牙根尖已发育完毕，难以利用自身的SCAP归巢达到牙髓再生。从成熟牙齿的血凝块采集的样本中，牙源性间充质干细胞标记物的浓度之间存在很大的差异，这表明年龄、性别、牙齿类型等因素均可影响这些细胞的相对丰度。许多实验及临床实践采用牙髓干细胞（DPSC）用于牙髓再生，但从成熟恒牙中分离出的大多数DPSC并非干细胞，而是处于成熟各阶段的牙髓成纤维细胞。真正可以行使干细胞功能的DPSC可能在体内处于低功能状态，无法像牙齿发育形成时期那样分化为成牙本质细胞并产生大量牙本质。这些都是成熟恒牙牙髓再生面临的难题。
    有病例报道通过移植外源性干细胞成功实现了成熟恒牙的牙髓再生。因此，移植从自身智齿或是因非感染性疾病拔除的患牙中获得的DPSC或SCAP或许是较好的解决方法。对成熟恒牙来说，牙周膜干细胞及牙槽骨干细胞也不失为基于细胞归巢技术的牙髓再生的较好的干细胞来源，但牙本质及血凝块中含有的内源性生长因子是否可以诱导牙槽骨干细胞及牙周膜干细胞分化为牙髓样组织还需要进一步研究。
    除了上述干细胞外，骨髓间充质干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞等也可能作为牙髓再生组织工程的细胞来源，且可以成功地在体内诱导再生出牙髓样组织。尽管它们的成牙本质及成骨能力较低，且诱导形成的牙髓组织量少于DPSC，但对成熟恒牙来说，是可以考虑的替代手段。
    4.生长因子及支架的应用
    成熟恒牙的牙髓炎及根尖周炎发生于中老年人的比例较高。衰老引起的全身系统性变化导致宿主干细胞巢微环境发生的改变不利于间充质干细胞发挥作用。个体衰老会提高间充质干细胞的免疫原性，降低对T 细胞的免疫抑制，对干细胞移植造成阻碍。血管内皮生长因子是由牙髓细胞分泌并参与牙髓修复过程的重要细胞因子，成熟恒牙中的血管内皮生长因子表达较弱，尤其是在冠部和根部。
    这些研究提示，寻找可调节宿主间充质干细胞巢微环境的信号通路及相关因子，可以改善衰老微环境对牙髓再生的不利影响。生长因子可以改善微环境，调节干细胞与前体细胞的附着、增殖、分化以及促进组织再生。常用的生长因子包括成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子等。对于细胞归巢法来说，因干细胞源于自身根尖周部位，如何应用趋化诱导因子更为重要。
    支架是牙髓再生必须的支持系统，它可以为移植细胞提供营养物质以维持细胞的存活。支架必须具有良好的生物相容性，可聚集并控制生长因子的释放、协调组织形成，可降解，并具有最小的细胞刺激性或毒性。在细胞归巢技术中，常常将根尖引出的血凝块作为生物支架以促进干细胞的增殖分化，学者们也探索了各种各样的可应用于牙髓再生技术的生物支架。如富血小板血浆、富血小板纤维蛋白、胶原、聚乳酸、水凝胶等。
    5.结语与展望
    牙髓再生技术具有美好的应用前景，但实现成熟恒牙真正的牙髓再生，恢复牙髓牙本质复合体的功能仍有很大的技术难度。已有多例临床病例报告成熟恒牙的牙髓再生是可以实现的，但针对成熟恒牙牙髓再生的临床研究及基础研究仍很少，未来还需要更多学者不断努力，改进牙髓再生中的感染控制技术，寻找适宜的再生干细胞、生长因子和支架以改善牙髓再生预后效果，扩展牙髓再生适应证。