即使经过完善的机械和化学预备，根管内的微生物仍可能在牙本质小管中保持活性。若根尖封闭不严密，根管内残留的病原菌及其代谢产物进入根尖，会造成根尖区持续性的炎症反应。由此可见，在根尖外科手术中进行严密的根尖倒充填非常必要，目的是为了获得良好的根尖封闭性，诱导根尖周组织愈合。
根尖微渗漏是导致根尖手术失败的重要原因。微渗漏受到众多因素的影响，如复杂的根管解剖结构、根尖切除和倒预备技术、倒充填材料的物理和化学性质，以及不同的倒充填技术和倒充填质量等。根尖切除和根尖倒预备是根尖外科手术的重要步骤，通过根尖3 mm的切除和根管的清理成形可去除根尖大部分残留的感染组织，但是根管的解剖结构复杂且存在变异，根管峡部清理不全仍是导致手术失败的重要原因。根管峡部被定义为2个根管之间狭窄的带状、鳍状或网状连通。
在存在2个根管的牙根中，峡部非常普遍，例如磨牙的近中根、前磨牙以及下颌切牙。Arx等检查根尖手术中患牙的根尖切除面，发现2/3的牙齿根尖存在峡部，59.4%的牙齿存在峡部根管系统充填不完善的情况。下颌第一磨牙近中根是峡部存在的常见位置，发生率为55.5%~88.5%。
Yoon等分析了非手术根管治疗失败的下颌第一磨牙的根管横断面，结论认为其近中根复杂的解剖结构是传统根管治疗失败的重要原因。现代根尖手术可在显微镜下行根尖切除和倒预备以提高倒充填的质量，但是倒充填材料的严密封闭仍然是影响根尖手术预后的重要因素之一。Setzer等对20例根尖手术失败病例进行评价，发现60%的病例存在根尖倒充填不足是导致手术失败的重要原因。一项系统评价和Meta分析显示：倒充填材料是影响显微根尖外科手术长期预后的主要因素之一。
一项回顾性研究对424颗磨牙根尖手术的结果进行了评估，结论认为：根尖倒充填材料、随访时间和基于锥形束CT （one-beam computed tomography，CBCT） 的术前评估是影响根尖周组织愈合的重要因素。另一项回顾性研究结果显示：显微根尖外科手术中使用的根尖倒充填材料和术前的非手术根管再治疗可能会影响手术的长期预后。根尖手术后的微渗漏可能发生在倒充填材料与牙胶之间、倒充填材料与牙本质壁之间以及倒充填材料的内部。在根尖手术中获得良好的根尖封闭性非常重要，因此有必要对倒充填材料的根尖封闭性进行体内和体外的评价。
根尖封闭性的体外评价一般采用离体人牙或犬牙建立根尖倒充填模型，评价方法主要包括染料渗漏法、三维图像分析、细菌和内毒素渗漏法、流体过滤法和葡萄糖渗漏法等。除了三维图像分析外，所有方法均采用测量物质通过根尖的渗漏量来间接评价封闭性。常用水、小分子化合物或细菌等的渗漏量来进行根尖封闭性的评价。本文对上述方法用于根尖倒充填封闭性体外评价的研究进展、技术优势与局限性进行综述。
1.染料渗漏法
染料渗漏法是最常用和简单的评价根尖倒充填封闭性的方法。染料渗漏法的原理是将除根尖外密封的样本浸泡于染料，经过一定时间后测量染料通过根尖的渗漏量。常见的染料有1%~3%的亚甲基蓝染料，此外罗丹明B染料等也有报道。评价染料渗漏量的方法一般有3种。
1） 经典的染料渗漏法。将模型纵向或横向切开，显微镜放大观察后采集图像，采用软件测量其最大线性渗漏深度。Corsentino等使用亚甲基蓝染料评价2种根尖倒充填材料在不同的倒预备长度下的封闭性能，结果发现生物陶瓷材料Biodentine具有比Super-EBA更少的微渗漏。罗丹明B染料也在经典的染料渗漏法中有应用。
Singh等使用罗丹明B染色结合激光共聚焦显微镜比较了不同根尖倒充填材料的封闭能力，发现Biodentine根尖封闭能力表现最好，其次是无机三氧化物聚合物（mineral trioxide aggregate，MTA）、金属陶瓷材料、树脂改性玻璃离子水门汀（resin-modified glass ionomercement，RMGIC） 和银汞合金。
2） 染料提取法。将样本浸泡于亚甲基蓝染料一段时间后再浸入硝酸溶液中提取染料，采用分光光度分析法等测量染料渗漏量。Nepal等采用这种方法比较了3种不同倒充填材料的根尖封闭性，发现Biodentine和MTA的微渗漏显著低于玻璃离子水门汀（glass ionomer cement，GIC）。Gupta等采用同样的方法评价了几种新型生物陶瓷材料根尖倒充填的微渗漏，结果显示Biodentin和Bioaggregate的微渗漏明显低于MTA Plus和MTA。
3） 透明牙技术。首先使用印度墨水或亚甲基蓝染料对标本进行染色，再采用脱矿技术使牙齿变透明，最后在显微镜下评价根尖染料渗漏的范围。
Džanković等采用该技术比较几种材料的封闭性能，结果发现Biodentine作为倒充填材料较MTA和Fuji Ⅸ具有更好的根尖封闭性能。Yazdizadeh等采用该技术证明MTA在时间充足且存在水分的情况下凝固能获得更好的根尖封闭性。染料渗漏法操作简单且应用广泛，但染料的选择、浸泡时间和样本中残留空气均会影响实验结果。横切或纵切法无法测量染料三维方向的渗漏；染料提取法和透明牙技术存在染料溶解的问题，影响测量的准确性；染料渗漏边界的确定易受操作者主观影响。尽管如此，操作简单和成本低廉仍然是该方法最大的优点，经过改进后该方法也越来越趋于客观，并可获得定量结果。在比较各种根尖封闭性评价方法时，染料渗漏法也是最常用的对照方法。
2.三维图像分析
三维图像分析一般指采用微型计算机断层扫描（micro-computed tomography， Micro-CT） 或扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM） 扫描样本后进行分析的方法。Micro-CT分析一般通过合适的阈值调整来区分样本各部分和空隙，随后通过软件进行三维重建和空隙率分析。SEM可以在切片后直接观察到充填材料进入牙本质小管及对其适应的情况。Micro-CT和SEM在评价根尖倒充填材料空隙率的研究中应用广泛。
Kim等利用Micro-CT评价牙本质和根尖倒充填材料之间的空隙率，结果显示ProRoot MTA倒充填的空隙率高于MTA Angelus、EndoCem MTA和RetroMTA。Jardine等采用Micro-CT 评价3种硅酸钙基生物陶瓷材料根尖倒充填后的边缘空隙和内部空隙，结果是MTA Angelus、Biodentine和Neo MTA Plus之间没有差异。
Gülses等使用SEM比较5种根尖倒充填材料的边缘适应性，结果表明Diaket是最适合的倒充填材料，其次是AH-Plus和快凝Super-EBA，再次是Super-EBA、ProRoot MTA 。Mody等使用SEM评价血液和人工唾液污染对MTA 根尖倒充填边缘适应性的影响，证明血液对MTA封闭性的影响更大。
Al-Fouzan等使用Micro-CT和SEM 评价根尖牙本质预酸蚀对白色和灰色MTA边缘适应性的影响，结果发现预酸蚀只能增加灰色MTA的根尖封闭效果。三维图像分析是评价根尖倒充填封闭性直观、简单的方法，主要局限性在于：Micro-CT分析结果与扫描参数及阈值选择等相关，充填材料也可能造成伪影；SEM只能得到个别平面的空隙情况。尽管如此，该方法与临床影像学检查关系密切，且三维定量测量具有可靠性，具有一定的临床价值。
3.细菌和内毒素渗漏法
细菌和内毒素渗漏法一般采用双室渗漏模型。双室渗漏模型的原理是构建上下两个封闭且无菌的腔室，两者仅仅通过样本的根尖部分相联通。上腔室中放入细菌悬浮液，细菌通过根尖进入下腔室，通过检测下腔室中的细菌或内毒素来评价根尖的封闭性。粪肠球菌是难治性根尖周炎中的主要细菌，因此常常用于细菌渗漏模型。
一般来讲，下腔室中细菌渗漏只能采用定性的分析方法。具体方法是观察一定的时间或直到所有样本发生渗漏后进行生存分析，比较一定时间内发生细菌渗漏的样本数或所有样本发生渗漏所需的时间。目前已有很多研究采用粪肠球菌双室渗漏模型对根尖倒充填材料的平均渗漏时间进行定性比较。细菌渗漏法无法对渗漏的细菌进行准确的定量分析，因为下腔室中检测到的细菌量与培养条件和培养时间等关系密切。
尽管如此，仍有一些研究在这方面进行了尝试。常见的方法有菌落形成单位计数（colony-forming units，CFUs）、SEM观察、分光光度法测定细菌浊度等。Antunes等和Nair等使用粪肠球菌渗漏模型比较MTA和EndosequenceBC RRM的根尖封闭能力，CFUs结果显示2种材料的根尖封闭性相似。Lertmalapong等利用粪肠球菌渗漏模型的定性和SEM分析比较了5种生物活性陶瓷材料的根尖封闭性，结果表明Biodentine、膏状TotalFill BC RRM和ProRoot MTA比TotalFill BCRRM糊剂和RetroMTA发生根尖渗漏更少。
Espir等通过分光光度法测定下腔室的细菌浊度，MTA和氧化锆硅酸钙基材料（calcium silicate cement with zirconium oxide，CSC/ZrO2） 表现出比氧化锌/丁香酚（zinc oxide/eugenol，ZOE） 更低的细菌渗漏率。表皮葡萄球菌在细菌渗漏模型中的应用也可见报道。Asnaashari等使用表皮葡萄球菌渗漏模型研究根尖倒充填材料的封闭性，结果发现ProRoot MTA、Root MTA和Portland cement的根尖封闭性相似。与细菌渗漏实验不同，内毒素渗漏实验中上腔室一般是混合的细菌悬浮液。
Tang等使用内毒素渗漏法评价了MTA根尖倒充填的渗漏性，结果发现该材料具有出色的根尖密封能力。细菌及其产物是牙髓病和根尖周病的主要致病因素，因此使用细菌和内毒素渗漏法作为评价根尖倒充填封闭性的指标是十分合理的；但所有细菌渗漏模型都有一定的局限性，主要来自充填材料本身抗菌性的影响和与其他根尖封闭性评价技术结果的不一致。从另一个角度考虑，该方法同时评价了材料在实际应用中的抗菌性和封闭性效果，实验结果的差异也可见于其他方法。因此，作为评价根尖封闭性的方法之一，细菌和内毒素渗漏实验仍是一种有价值的选择。
4.流体过滤法
1986年，Derkson等开发了流体过滤法用于测量牙科修复材料的微渗漏。Wu等在1993年对其进行改良并将其用于测量根管微渗漏，结论认为该方法是一种比染料渗漏法更灵敏的检测根管充填物空隙的方法。流体过滤法一般是以蒸馏水作为示踪剂，将牙齿模型安装在流体输送装置中。
牙根冠部与压力下充满水的管相连接，根尖部与含一个气泡的毛细管相连接。通过检测毛细管中移动的气泡，可以定量测量液体经过根尖部的输送情况。流体过滤法在根尖倒充填封闭性的评价中应用广泛。Shetty等使用流体过滤法比较4种根尖倒充填材料封闭能力，结果发现MTAAngelus的密封能力表现最佳，其次是Biodentine、MTA Plus和GIC。
Ayatollahi等使用该方法评价了不同粉液比的富含钙混合物（calcium-enriched mixture，CEM）根尖倒充填的微渗漏，发现3∶40的粉液质量比可以达到最好的根尖封闭能力。Garip等则用此方法评价了不同根尖切除角度对根尖封闭性的影响，发现根尖切除角度的变化并不一定会导致微渗漏的差异。
Amoroso-Silva等用该方法比较了树脂基根管封闭剂和硅酸钙基倒充填材料的根尖封闭性，结论是两者的界面适应性相似。Bani等通过该方法比较了2种根尖倒充填材料，结论是任何厚度的Biodentine都有与MTA 相媲美的根尖封闭能力。流体过滤法相比染料渗漏法的优点在于能自动记录并提供敏感、精确的测量数据，然而该方法仍具有一定的局限性：实验实施必须有特殊的仪器；目前没有统一的标准，毛细管直径、压力大小和测量时间都可能改变实验结果。未来需要进行更多研究并制定统一的标准。
5.葡萄糖渗漏法
葡萄糖渗漏模型同样采用双室渗漏模型。葡萄糖是该方法的示踪剂，其分子尺寸小且是细菌的营养物质，具有很好的临床相关性。葡萄糖渗漏模型一般包括无加压装置和有加压装置2种：前者往往依赖大气压力使葡萄糖从上腔室渗漏到下腔室，后者通过与加压装置相连可以在短时间内加速葡萄糖的渗漏。加压装置的存在极大地缩短了实验时间，降低了细菌生长和水分蒸发的风险，同时能保持检测渗漏样本的能力。
Leal等通过与压力装置相连的葡萄糖渗漏模型比较了3种材料的根尖封闭能力，结论是Ceramicrete的葡萄糖渗漏率明显低于BioAggregate，但二者与白色MTA无明显差异。Nikhil等分别使用有加压装置的葡萄糖渗漏法、液体过滤法和染料渗漏法评价了MTA的根尖封闭性，结果发现3种方法的结果之间没有相关性。
葡萄糖渗漏法的优点包括无创和临床相关性强，在检测渗漏方面敏感性强。它的主要局限性在于葡萄糖与实验材料的相互反应。有研究显示：多种根管充填材料能与葡萄糖溶液发生反应，因此不应使用葡萄糖渗漏模型评价这些材料的封闭能力。此外，实验周期长、难以维持无菌系统、葡萄糖消耗以及水分蒸发的风险也是该方法的缺点。加压装置的使用在很大程度上解决了这方面的问题，但更完善的实验方法仍需要进一步探索。
6.其他方法
其他一些方法，如电化学法、蛋白质渗漏法、放射性同位素渗漏法、铜离子渗漏法、高效液相色谱-串联质谱法和实时流量测量法等也可用于评价根尖封闭性，但在根尖倒充填模型中的应用较少。电化学法依赖于离子通过狭窄空间的扩散，离子扩散在2个电极之间产生的电流大小与渗漏量成正比。
Martell等通过电化学法评价3种根尖倒充填材料，发现MTA的渗漏明显少于IRM和SuperEBA，但其结果与染料渗漏法不完全一致。电化学法的优点是可持续监测和定量分析根尖微渗漏情况，缺点在于电解液和电极的存在可能使充填材料的某些成分电解，干扰离子的流动从而导致错误的结果。
蛋白质渗漏模型一般是在双室模型中进行，多采用大小介于染料和细菌之间的白蛋白。Malcic等通过牛血清白蛋白渗漏法来比较SuperEBA和IRM根尖倒充填的封闭性，结果显示联合使用正向充填和SuperEBA根尖倒充填的样品发生的根尖渗漏更少。蛋白质渗漏法的缺点和葡萄糖渗漏法相似。放射性同位素渗漏法是使用放射性同位素作为示踪剂对样本进行放射自显影分析。
Haïkel等使用125I放射性标记溶菌酶定量分析渗漏的方法比较了不同根管封闭剂的根尖封闭性，结果发现AH Plus和Sealapex表现出比Sealite更好的根尖封闭性。放射性同位素渗漏法的不足主要在于：二维放射自显影图像不能代表微渗漏的三维情况；某些同位素（例如45Ca） 对牙齿结构或修复材料具有亲和力，可导致测量误差增加；某些体积小的同位素可以穿过牙齿结构或修复材料，可被误认为是渗漏；放射污染和损害等。
铜离子渗漏法通过原子吸收光谱仪测量从冠部扩散到根部的铜离子。Modaresi等使用硫酸铜溶液渗漏法和染料渗漏法来评价根管治疗的根尖封闭性，发现2种方法之间没有相关性。该方法的优点在于牙齿结构中不含铜离子，不会干扰其他元素的吸收光谱；缺点在于应用很少且与其他方法相关性差。Michelotto等使用咖啡因作为示踪剂的高效液相色谱-串联质谱法对根管封闭剂的微渗漏进行定量测量，结果显示AH Plus的根尖封闭性较Sealapex更好。
Park等使用实时流量测量设备在静水压力下精确追踪通过根管充填材料的液体流动，结果发现牙胶结合AH 26、牙胶结合EndoSealMTA和Biodentine三者的根尖封闭性没有明显差异。目前上述方法主要应用于根管充填和根管封闭剂的根尖封闭性评价，对于根尖倒充填封闭性的评价有待更多的研究验证和进一步优化。
7.结论
根尖倒充填封闭性的体外评价存在局限性，但它可以作为新材料和技术的初步筛选方法，仍然具有重要的研究价值。染料渗漏法和三维图像分析是简单、常用的方法，但影响因素多且受主观因素影响较大；细菌和内毒素渗漏法、流体过滤法、葡萄糖渗漏法能较客观地分析根尖微渗漏情况，但缺乏统一标准且结果易受多种因素影响；其他方法也有报道，但目前研究较少且质量较低。通过扩大样本量和设置适当对照等途径可有效减少各种因素的干扰。对这些评价方法来说，如何更加客观准确地评价根尖倒充填封闭性，如何统一各种评价参数和标准，是未来亟待解决的问题。
