牙髓神经在牙髓组织损伤修复中作用的研究进展

    牙髓是富含血管、神经、淋巴管及多种细胞和细胞外基质的疏松结缔组织，具有形成牙本质、营养、感觉、防御的功能。牙髓防御和修复功能是牙髓损伤修复的生物学基础。以往的研究重点多聚焦于牙髓损伤后的血管、免疫炎症反应和干细胞的作用，而牙髓神经在这一过程中的作用尚未明确。
    牙髓神经占牙髓组织体积的40%，神经纤维束通过根尖孔进入髓腔，与血管伴行形成神经血管束，周围聚集免疫细胞和牙髓干细胞等驻留细胞。牙髓神经与周围组织细胞的这种密切解剖关系，是感受刺激、调节血管、参与免疫防御以及维持干细胞稳态等功能的基础。
    而当受到外界刺激时，牙髓神经不仅能即刻感知刺激，并因其具有可塑性（neuroplasticity），可直接释放神经递质等作用于周围组织细胞，同时还可出芽生长，改变形态结构，影响周围组织细胞。由此可见，牙髓神经与牙髓损伤修复密切相关，一方面损伤刺激导致牙髓神经改变，其可能是牙髓损伤修复的始动因素，另一方面牙髓神经对牙髓修复相关的各组织细胞进行调节。
    因此，本文就牙髓神经来源分布以及生理状态下和损伤修复过程中牙髓神经组成结构、相关分子信号以及作用等研究的最新进展进行综述，以期更加全面理解和认识牙髓组织损伤修复与再生过程，为临床治疗提供理论基础。
    1.牙髓神经的来源和分布
    牙髓神经来自三叉神经节和颈上神经节，包含感觉神经纤维和交感神经纤维，其中感觉神经纤维是牙髓神经的主要构成部分。牙髓神经纤维集合成束通过根尖孔进入根管内后产生分支，在中央区较粗大，在其冠方及周围区域分支逐渐变细，可终止于多细胞层的细胞外基质，亦可终止于成牙本质细胞、前期牙本质或牙本质小管内150μm处。
    牙髓神经分布与血管及多种细胞等关系密切。Franca等通过组织透明技术对牙髓神经和血管进行三维成像发现牙髓神经纤维束始终与血管伴行，通常按照以下3种方式排列：（1）神经纤维束沿着血管延伸；（2）相邻神经纤维束分支螺旋包绕血管；（3）神经纤维束完全包围血管。同一血管在走行全程可同时具有以上3种神经伴行方式，受来自不同神经纤维束的神经纤维支配，形成复杂的血管神经网络。
    另外，牙髓神经与牙髓组织中牙髓成纤+维细胞、牙髓干细胞、成牙本质细胞以及免疫细胞的分布密切相关，并且有研究表明这些细胞的数量可能受神经血管束的调节。牙髓神经与周围组织细胞的解剖生理特征为其相互作用提供了坚实的生物学基础。
    2.牙髓神经的组成结构
    牙髓神经组织主要由神经元轴突（神经纤维）及周围的施万细胞构成。根据施万细胞是否形成髓鞘可分为有髓神经纤维和无髓神经纤维。绝大多数牙髓神经纤维为有髓神经纤维，施万细胞螺旋盘绕轴突数层而成。轴突直径1~12μm，表面有轴膜，内含具流动性的轴浆，轴浆内有大量微管、微丝、滑面内质网和小泡等，能在神经末梢处释放神经递质以及摄取神经营养因子并运输至神经元胞体，实现双向轴突运输。成髓鞘施万细胞胞质不均匀，细胞器丰富，内含大量微管微丝，细胞膜上常见吞饮小泡，能分泌细胞因子和吞噬神经损伤后的溃变轴突和崩解髓鞘。
    牙髓中无髓神经纤维较少，由施万细胞单层包裹或非完全包裹轴突，轴突直径通常在1μm以下，无髓鞘，非髓鞘施万细胞呈细长条形，胞质较均匀，内含大量细胞器，也具有分泌和吞噬功能，但与成髓鞘施万细胞区别尚未明确。龋病或牙髓炎症发生后神经纤维密度和数量以及施万细胞数量和分布规律都会发生改变，但目前尚未见牙髓损伤修复后神经组织结构变化的报道。
    3.牙髓神经相关的信号分子
    牙髓神经纤维以及施万细胞可释放多种信号分子，根据其在神经组织中作用的不同可分为小分子神经递质、神经肽、神经营养因子和轴突导向分子。这些信号分子不仅作用于神经，同时也作用于邻近组织细胞等，参与调节牙髓损伤前后牙髓牙本质复合体的稳态平衡。
    3.1 小分子神经递质
    小分子神经递质在神经元胞体中合成，储存在轴突中的突触小泡中。牙髓生理状态下有乙酰胆碱、谷氨酸、γ-氨基丁酸、儿茶酚胺、5-羟色胺等的表达，主要以旁分泌方式传递信号，速度快、准确性高，发挥传递信息、调节血流的作用。牙髓受到外界刺激后，谷氨酸、γ-氨基丁酸、儿茶酚胺等的表达升高，这可能与损伤后牙髓疼痛及牙髓血管扩张和通透性增加有关。
    3.2 神经肽
    神经肽是一种生物活性多肽，主要由神经元细胞体产生，通过轴突转运到牙髓神经末梢并释放，牙髓成纤维细胞等非神经细胞也能表达神经肽。牙髓生理状态下神经肽的表达水平较低，可检测到降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）、P 物质（substance P，SP）、神经激肽A（neurokinin A，NKA）、神经肽Y（neuropeptide Y，NPY）、血管活性肠肽（vasoactive intestinal polypeptide，VIP）和神经分泌素（secretoneurin，SN）的表达。神经肽除了作为神经递质，也作为免疫活性分子和生长因子等在牙髓中发挥重要作用。
    3.2.1 CGRP
    CGRP是感觉神经末梢释放的主要神经肽，当牙髓受到电、热、化学、机械刺激以及发生龋坏时表达水平均升高。CGRP可能与血管扩张、炎症反应和修复性牙本质形成均相关。CGRP是已知最强的扩血管物质，92%的牙髓血管相关神经表达CGRP。Calland等研究表明CGRP可促进牙髓细胞增殖，还可以通过增加BMP-2的释放，刺激成牙本质细胞的分泌活动，促进修复性牙本质形成。
    但Michot等的体外实验表明CGRP对牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）的增殖有抑制作用，但对其成牙/成骨向分化却没有明显作用。CGRP可能通过不同方式影响DPSCs介导的牙髓损伤修复再生，其作用机制和作用条件尚待进一步探究。
    3.2.2 SP
    SP不仅由感觉神经表达，牙髓成纤维细胞也可表达，龋病、漂白治疗和炎症牙髓中的SP水平明显增加。目前研究表明SP主要与血管扩张、血管生成以及促炎因子的升高有关。Karabucak等研究发现SP能通过激活内皮细胞一氧化氮合酶（NOS）来诱导一氧化氮（NO）的产生，从而舒张牙髓血管。在血管生成方面，SP不仅可以促进血管内皮细胞增殖分化，还能作用于粒细胞和巨噬细胞，使其释放具有调节血管生成功能的酶和细胞因子。
    另外，SP还可以作为一种免疫活性物质刺激单核/巨噬细胞产生IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α；SP能激活肥大细胞特异性受体Mas相关的G蛋白耦联受体MRGPRX2，促进TNF-α、IL-8、CCL2、CCL3等的释放。
    3.3 神经营养因子
    神经营养因子是一组促进神经细胞生长、增殖，维持生存并调节其分化和形态重塑的特异性内源性信号蛋白。牙髓神经纤维、施万细胞、牙髓成纤维细胞和成牙本质细胞均可表达神经营养因子，包括神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、脑源性生长因子（brain-derived neuotrophyic factor，BDNF）、神经营养因子3（neurotrophin3，NT3）和神经营养因子4/5（neurotrophin4/5，NT4/5）。神经营养因子通过与酪氨酸受体激酶TrkA、TrkB和TrkC以及p75NTR受体作用启动信号，牙髓成纤维细胞和成牙本质细胞表面也表达神经营养因子受体。
    神经营养因子能够通过影响DPSCs的增殖、迁移和分化促进牙髓损伤修复。Luzuriaga等研究表明BDNF和NT3能够促进DPSCs介导的神经组织再生；Xiao等证明BDNF和NT4/5 通过激活MAPK 通路促进细胞迁移；Mizuno等发现NGF、BDNF、NT3、NT4/5都能增加牙本质涎/磷蛋白、Ⅰ型胶原、骨桥蛋白和骨形态发生蛋白2的表达，并促进矿物沉积。此外，神经营养因子还可能参与调节炎症反应以及牙髓干细胞的增殖、凋亡、迁移和分化。探究神经营养因子在牙髓组织损伤修复中表达水平和作用，对于牙髓功能性修复再生具有重要意义。
    3.4 轴突导向分子
    轴突导向分子（axon guidance molecules，AGMs）是在神经生长发育以及损伤后，引导新生轴突沿特定方向延伸的吸引或排斥性导向分子，包括Netrins、Semaphorins、Slits 以及Ephrins 等。目前牙髓中已有Semaphrins和Ephrins的相关研究。牙髓损伤后，AGMs的水平发生不同改变。AGMs可能参与免疫炎症反应以及牙髓细胞的增殖分化过程，对损伤牙髓的修复发挥积极或消极影响。
    3.4.1 Semaphrins
    Semaphrins家族广泛存在于神经组织，也可由牙髓细胞和成牙本质细胞表达。Semaphrins家族可影响牙髓炎症发展、修复性牙本质和血管的形成。Shindo等发现Sema3A能抑制NF-κB信号通路的活化，从而部分抑制TNF-α引起的牙髓细胞IL-6和CXCL10水平的增加。
    Yoshida等研究表明Sema3A 促进DPSCs的迁移、增殖和成牙向分化，并可能通过经典Wnt/β-catenin信号途径在牙本质再生过程中发挥作用；Zou等认为Sema4D抑制DPSCs的成牙向分化，但能活化AKT/ERK1/2信号通路促进DPSCs向内皮细胞分化，为牙髓组织再生开辟新的路径。
    3.4.2 Ephrins
    Ephrins家族是受体酪氨酸激酶亚家族Eph的配体，二者相互接触发挥双向信号转导功能。目前研究表明，牙髓中EphB1、EphrinB1和EphrinB3主要在成牙本质细胞层和牙髓干细胞周围表达；EphB4和EphrinB2在血管周围表达。目前研究多集中于Ephrins家族对DPSCs的影响。
    Stokowski等发现EphB/EphrinB的相互作用能限制稳态下DPSCs的附着和迁移；Gong等发现EphrinB2/EphB4信号通路能调控DPSCs诱导毛细血管出芽和层粘连蛋白沉积，促进血管新生；Wang等研究表明EphrinB2及其同源受体EphB2和EphB4可提高成骨/成牙向分化相关的基因和蛋白水平。目前关于牙髓中轴突导向分子的研究还相对较少，且对组织病理生理状态发挥的调节作用尚待进一步探究。
    4.牙髓神经在牙髓组织损伤修复中的作用
    牙髓防御功能是牙髓组织损伤修复的生物学基础，包括疼痛、炎症反应和修复性牙本质形成，牙髓神经在其中均发挥重要作用。
    4.1 感觉疼痛
    疼痛是生物体升级其防御系统的产物。神经组织与成牙本质细胞共同组成独特的感觉系统，形成监测和防御的第一道防线，可在几毫秒内转导外界刺激信号，外界刺激和损伤即会引起与中枢神经系统相关的防御性反射并起到警示作用。牙髓游离神经末梢感觉功能单一，但敏感性高、传导速度快。牙髓中不同类型神经纤维感受的疼痛方式不同。有髓神经纤维感受来自牙本质和周围牙髓的较低阈值的刺激，表现为尖锐刺痛，疼痛快速短暂；无髓神经纤维感受牙髓损伤等较高阈值的刺激，表现为烧灼样跳痛、钝痛，疼痛持续，前者在牙本质敏感性中起重要作用，后者在牙髓炎性疼痛和牙髓损伤中起重要作用。
    4.2 调节炎症反应
    牙髓损伤后，牙髓血管扩张，通透性增加，炎性渗出液和免疫细胞渗出，炎症反应激活。神经系统和免疫系统在该过程中可进行双向通讯，两者的相互作用和功能合作是维持组织动态平衡的基础。首先，外界刺激引发神经源性炎症。神经电信号传导速度远大于免疫细胞释放炎症介质速度，而且免疫细胞膜表面表达大量神经信号分子的受体，如巨噬细胞、树突状细胞、T细胞等，当神经率先感受外界刺激后，直接释放信号分子扩张血管，招募并激活免疫细胞。
    而免疫细胞也可合成和释放经典神经递质，如乙酰胆碱和多巴胺等，调节局部神经组织行为并进一步影响更复杂的神经免疫调节回路。目前关于牙髓神经免疫调节的研究较少。Fristad等发现失神经支配的大鼠磨牙炎症牙髓组织中，免疫细胞的数量明显低于正常牙髓组织；但在正常牙髓组织中，免疫细胞的数量几乎不受失神经影响。其次，神经可能参与炎症的转归。
    Yoshiba等发现损伤牙髓修复后，施万细胞能促进巨噬细胞向M2型极化。据此可初步推测牙髓神经在损伤初期释放信号分子引发神经源性炎症，反射性调节血管扩张和通透性，招募免疫细胞至损伤部位，并且影响免疫细胞的活性和功能；而神经-免疫双向通讯促进炎症消退，防止过度的炎症浸润，为后续修复提供一个适宜的免疫微环境。牙髓损伤后神经-免疫在炎症发展和消退过程中的相互作用及作用机制尚需进一步研究。
    4.3 促进修复性牙本质的形成
    修复性牙本质的形成能够抵御外界刺激，维持牙髓牙本质复合体的正常功能。当成牙本质细胞受损时，牙髓干细胞能分化为成牙本质细胞样细胞，分泌基质，从而形成修复性牙本质。牙髓神经可通过提供干细胞来源和改变牙髓干细胞的生物学行为的方式促进这一过程。一方面，牙髓干细胞可来源于神经组织。Kaukua等采用克隆颜色编码技术与外周神经胶质追踪相结合的方式研究表明，牙髓中的施万细胞可转化为间充质干细胞，进而分化为成牙本质细胞样细胞。
    另一方面，牙髓神经具有可塑性，其本身在损伤后就具有修复再生的能力。损伤诱导施万细胞去分化，分泌神经营养因子和AGMs等，促进轴突的出芽，实现神经再支配。牙髓神经的可塑性可能影响牙髓损伤修复过程，神经感受损伤后能够通过释放不同种类的神经递质、神经肽以及神经营养因子等招募内源性牙髓干细胞，提高其增殖和成牙向分化能力，促进损伤处修复性牙本质的形成。
    5.小结和展望
    牙髓牙本质复合体在胚胎来源上具有一致性，而神经是串联这两种结构的重要媒介，因此对其特点和作用的探究具有重要意义。牙髓损伤后重建相似结构和恢复正常功能须有复杂的定向信号，从神经角度来说，周围神经强大的修复再生能力如何影响牙髓损伤修复过程尚不明确，目前的研究结果仅片段性地揭示了牙髓神经从发生改变到发挥作用的局部生物学事件，而大量下游细胞活动和分子信号交换仍然是未知的，相关信号分子的来源、分布、去向、影响因素和发挥作用的条件仍待继续探究。
    神经作为牙髓组织的主要组分之一，其解剖生理特点可能使其成为贯穿损伤修复全过程的始动者。随着研究的深入可能为牙髓疾病的治疗开辟新方向——即针对神经源性炎症消退以及包括神经在内的牙髓牙本质复合体修复再生的治疗新策略的发展。