【摘要】 目的 探讨牙龈卟啉单胞菌刺激牙髓细胞产生细胞因子的信号转导通路。方法 厌氧培养牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis），胞内感染原代培养牙髓细胞，RNA抽提，实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）检测Nods、Rip2，ELISA检测白细胞介素-6（IL-6）的表达水平。结果 牙髓细胞基础表达Nods、Rip2 mRNA及IL-6。P.gingivalis感染后2 h, Nods和Rip2 mRNA增高，达到高峰，6 h出现下降趋势。而P.gingivalis活菌刺激牙髓细胞能增强IL-6表达水平。结论 P.gingivalis能激活牙髓细胞固有免疫反应，通过Nod/Rip2途径进行信号转导上调细胞因子IL-6表达。
【关键词】 牙龈卟啉单胞菌 牙髓细胞 白细胞介素-6
牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）为G-专性厌氧、产黑色素、有菌毛的杆菌，是公认的成人破坏性牙周炎致病菌之一。研究[1-2 ]表明，牙龈卟啉单胞菌定植于感染根管内并与牙髓根尖周疾病的临床症状密切相关。牙龈卟啉单胞菌活菌能进入牙髓细胞内且能存活。牙龈卟啉单胞菌活菌胞内感染的牙髓细胞在一定时间内具有生物学活性[3]。因此认为牙龈卟啉单胞菌可能是牙髓根尖周疾病的主要致病菌。一类含有核苷酸结合寡聚域（nucleotide-binding oligomerzation domain，Nod）的蛋白质家族存在于植物、线虫、脊椎动物和人类的细胞内，在遗传上高度保守，是一种细胞内类型识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）[4]。
研究[5-6]表明，细菌及其产物进入宿主细胞后，可启动Nod对细菌进行识别，通过RICK/Rip2（receptor-interacting protein 2，Rip2）信号转导表达炎性细胞因子。牙龈卟啉单胞菌能侵入宿主细胞，诱导人成纤维细胞产生炎性细胞因子。但有关宿主细胞特别是口腔组织细胞，对牙龈卟啉单胞菌胞内感染的识别及其细胞因子表达与调控信号转导通路的研究，目前未见报道。因此本研究通过牙龈卟啉单胞菌侵入牙髓细胞内，应用逆转录-聚合酶链反应（reversetranscription-polymerase chain reaction，RT-PCR）、实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）和酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），检测胞内类型识别受体Nod、信号转导因子Rip2以及细胞因子白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的表达水平，探讨牙龈卟啉单胞菌激活牙髓细胞固有免疫反应产生炎症因子的信号转导通路。
1 材料和方法
1.1 牙髓细胞复苏和传代
取第3代冻存牙髓细胞，置于37 °C水浴快速解冻。取出细胞悬液，用10％胎牛血清DMEM（Gibco公司，美国）置入中号培养瓶，放入5% CO2孵箱37 °C培养。倒置相差显微镜下逐日观察，在细胞贴壁80％以上后，采用胰蛋白酶消化法收集细胞，按1∶3传代，7～10代用于实验。
1.2 P.gingivalis活菌感染牙髓细胞
取7～10代牙髓细胞，消化后计数，用20％胎牛血清DMEM配成每毫升2×105个细胞悬液，接种于培养瓶，每瓶5 mL，置于5%CO2，37 °C孵箱培养24 h后，换无双抗无血清DMEM培养基，培养24 h后备用。根据卢煜等[3]提出的牙龈卟啉单胞菌胞内感染牙髓细胞方法，按多重感染（multiplicitas of infec-tion，MOI）为100，将P.gingivalis活菌接种于牙髓细胞培养液中。阴性对照组以不含细菌的DMEM代替。
1.3 总RNA抽提和qPCR检测
Nod1、Nod2和Rip2分子引物序列见表1。利用提取总RNA的Trizol试剂，采用异硫氰酸胍-酸-酚一步法，利用Trizol试剂盒（Invitrogen公司，美国），按厂家说明书，提取细胞总RNA，分光光度仪测定A260 nm/A280 nm光密度值。采用ReverAid逆转录试剂盒（Fermentas公司，立陶宛）合成cDNA，然后进行PCR扩增反应。PCR条件为：94 °C预变性5 min，94 °C 30 s，58 °C 30 s，72 °C 30 s，35个循环后72 °C5 min，PCR产物琼脂糖95 V电泳后，制作标准曲线。按SYBR Premix EX Taq荧光定量PCR试剂盒（Takara公司，日本）说明操作，反应条件：95 °C 10 s后，95 °C 5 s，60 °C 31 s，72 °C 30 s，40个循环，根据标准曲线qPCR测定样本中Nod1、Nod2和Rip2 mRNA表达。
1.4 ELISA法测定培养上清液中IL-6质量浓度
按IL-6试剂盒（Diaclone公司，法国）说明操作：每孔加入100 μL重组标准品或待测样品和50 μL生物素标记的IL-6抗体，放入恒温振荡器37 °C振荡孵育1 h（120 r/min），3次洗板后加100 μL亲和素标记的HRP，37 °C振荡孵育30 min，3次洗板后再加入100 μL显示剂TMB，室温，暗室内孵育12~15 min，加100 μL终止液硫酸后在450 nm波长下读取吸光度，根据标准曲线计算IL-6质量浓度。
1.5 统计分析
采用SPSS 13.0统计软件进行分析，实验结果均作正态性检验、方差分析和t检验。
2 结果
2.1 牙髓细胞能表达胞内类型识别受体Nod1、Nod2及其信号转导分子Rip2
牙髓细胞表达胞内类型识别受体Nod1、Nod2及其信号转导分子Rip2的情况见图1，由图1可见，人牙髓细胞能基础表达胞内类型识别受体Nod1、Nod2和其信号转导分子Rip2 mRNA。
2.2 qPCR定量检测Nod1、Nod2和Rip2 mRNA表达
qPCR定量检测Nod1、Nod2和Rip2 mRNA的表达见图2，由图2可见，P.gingivalis胞内刺激人牙髓细胞后Nod1、Nod2 mRNA的表达高于未刺激对照细胞。感染2 h时Nod1、Nod2 mRNA的表达高于未受刺激组，达到峰值，然后逐渐降低，刺激6 h后其转录水平仅有2 h的一半左右，即使刺激24 h后，其在转录水平仍然高于未受刺激组。Rip2转录水平在刺激2 h后轻度增高，刺激6 h时与未受刺激组差别较小，刺激24 h后转录水平持续降低，甚至低于未受刺激组。
2.3 ELISA检测培养上清液中IL-6表达
ELISA检测培养上清液中IL-6表达见图3，由图3可见，人牙髓细胞基础表达IL-6。P.gingivalis活菌刺激人牙髓细胞后，培养上清液中IL-6的表达高于未刺激对照细胞。P.gingivalis活菌刺激人牙髓细胞1 h，IL-6水平表达开始增高，刺激后2 h表达出现下降，然后逐渐升高，持续至6 h，IL-6水平高于未受刺激组。
3 讨论
人宿主细胞固有免疫反应是机体防御外界微生物感染的第一道防线。当微生物刺激宿主细胞数分钟到数小时，宿主细胞通过类型识别受体对微生物识别，激活固有免疫反应产生细胞因子，清除微生物。当细菌胞内感染宿主细胞时，胞内类型识别受体Nod识别并启动信号转导通路产生免疫反应[7]。
3.1 牙龈卟啉单胞菌能激活牙髓细胞胞内类型识别受体的表达上调
利用前期建立的牙龈卟啉单胞菌活菌攻击牙髓细胞体外模型[3]，观察活菌感染细胞后Nod1、Nod2mRNA的表达水平，结果表明在活菌胞内感染牙髓细胞后Nod1、Nod2 mRNA的表达显著上调，并且随着刺激后时间的延长而减弱，而到刺激后24 h仍能检测到其表达的升高，证实了Nod1、Nod2在牙髓细胞对P.gingivalis活菌的识别中具有重要作用。特别是在P.gingivalis侵入细胞的早期，Nod1和Nod2转录水平的提高显示在细菌侵入的早期，牙髓即能对P.gingivalis进行识别和激活细菌入侵的信号，启动宿主的固有免疫系统功能，这对于牙髓组织对细菌的早期抵抗是非常重要的。
3.2 牙龈卟啉单胞菌能激活牙髓细胞固有免疫反应上调细胞因子IL-6表达
本实验研究结果显示牙髓细胞能表达IL-6。在P.gingivalis活菌刺激1 h后，IL-6水平即升高，刺激至6 h，IL-6水平仍高于未受刺激组，提示P.gingivalis通过牙髓细胞上调IL-6的表达，导致牙髓炎症反应的发生发展。这与其他学者研究[8-10]结果一致，牙龈卟啉单胞菌能诱导人成纤维细胞产生炎性细胞因子IL-6。
Darveau等[11]研究认为P.gingivalis侵袭宿主细胞表达细胞因子时，存在局限的化学因子麻痹（localizedchemokine paralysis），这可能是由于P. gingivalis中脂多糖（lippolysacchaid，LPS）[12]、牙龈素[13]除可以诱导宿主免疫反应外，亦能抑制细胞因子的表达，逃避宿主免疫防御机制。本实验研究结果显示P.gingivalis活菌刺激人牙髓细胞1 h，IL-6水平表达开始增高，刺激后2 h时表达出现下降，这可能与P.gingivalis的LPS、牙龈素降解产生的IL-6有关。
宿主抵御病原生物入侵的第一道防线是固有免疫，固有免疫的启动又调节和参与了适应性免疫[14]。P.gingivalis活菌刺激细胞1 h，IL-6水平即升高，至刺激6 h, 活菌组IL-6水平呈持续增长趋势。研究结果表明，活菌侵入细胞内行胞内感染，其早期就已启动牙髓组织固有免疫反应。经过初期阶段活菌在胞内持续感染，细胞因子表达持续增强，炎症反应进一步发展。这提示如果不能在牙髓炎症的早期就阻断炎症信号的转导，启动的固有免疫应答将调节适应性免疫应答，引导宿主级联反应，将会进展为广泛的不可逆的牙髓炎症。随着时间增加，活菌进入胞内后，不断进行生长繁殖，影响细胞活力，导致宿主细胞的生理功能受损，细胞因子产生下降，最后将死亡。
