【摘要】 目的 研究离体氟斑牙早期龋模型经再矿化处理后，釉质表面显微硬度及微观形貌的变化。方法 应用离体氟斑牙制备釉质样本40个，经酸蚀凝胶人工龋实验脱矿后，1.0%酪蛋白磷酸肽-磷酸钙（CPP-CP）再矿化液再矿化。采用显微硬度计测定各样本脱矿前后及再矿化后的显微硬度值。采用体视显微镜、偏光显微镜、透射显微镜以及扫描电镜观察釉质表面微观形貌。结果 脱矿前，釉质表面显微硬度值为（241.53±21.31） kHV；脱矿后，表面显微硬度下降到（175.76±24.99） kHV（P＜0.05）。其表面硬度损失百分比（%SMHD）为（27.23±4.79）％，表现为类似早期龋的表层下脱矿；再矿化后，表面显微硬度提高到（210.17±21.48） kHV（P＜0.05），其表面显微硬度恢复的百分比（%SMHR）为（52.32±4.23）％，主要表现为表层下再矿化。结论 再矿化处理对治疗氟斑牙早期龋有较好的临床效果。
【关键词】 氟斑牙 再矿化 显微硬度
氟斑牙是地区性氟中毒最常见的症状[1]，在我国为常见病、多发病。其病理机制尚不完全清楚[2]，有待进一步深入的研究。氟的再矿化作用已经得到充分的证明，其再矿化的机制主要是通过与过饱和状态的钙、磷离子结合，进一步促进钙、磷的沉积，形成新的抗酸的氟磷灰石晶体，实现再矿化[3]。非氟的再矿化液1.0%酪蛋白磷酸肽-磷酸钙（casein phosphopeptides stabilized calcium phosphate，CPP-CP）本身不含氟离子，防龋机制主要是通过稳定磷酸钙使溶液中存在高浓度的钙离子和磷酸离子。已有研究表明CPP-CP再矿化液对正常牙的再矿化作用时间和效力均强于普通只含钙磷的再矿化液[4-5]，是一种较好的非氟再矿化剂。因此，本研究通过研究新鲜离体氟斑牙早期龋模型经CPP-CP再矿化处理后，釉质表面显微硬度及微观形貌的变化，初步探讨CPP-CP再矿化处理对治疗氟斑牙早期龋损的修复作用，为临床治疗提供基础依据。
1 材料和方法
1．1 样本制备
取四川南部及贵州习水高氟地区因牙周病、正畸减数或智齿阻生拔除的完整无龋坏、新鲜离体氟斑牙85颗，根据Thylstrup-Fejerskov Index（TFI）氟斑牙分级标准[6]，实验组选取评分在1~4分的氟斑牙40颗，对照组为10颗新鲜完整无龋坏的正常牙。低速涡轮机流水下分离冠根。近远中向纵剖为二，在每颗牙的唇面或舌面中随机选取一面（已有研究[7]表明，同一颗氟斑牙的唇面和舌面釉质中的氟含量没有显著的区别）。用环氧树脂加压包埋，暴露唇/舌面，打磨抛光，制成实验组样本40个，对照组样本20个。超声清洗，置于4 ℃的去离子水中储存备用。
1．2 脱矿实验
用酸蚀凝胶[8]（0.1 mol/L乳酸，500 mg/L羟磷灰石，20 g/L羟乙基纤维素，0.05%叠氮钠，pH值4.5）作脱矿处理。每个样本加入20 mL脱矿液，并置于37 ℃孵箱，每天更换1次液体，3 d后取出，去离子水（pH=7.0）冲洗吹干备用。
1．3 再矿化实验
用1.0%CPP-CP再矿化液[9]（体积浓度为1.0%的CPP，60 mmol/L CaCl2，36 mmol/L磷酸钠，pH值7.0）作再矿化处理。每个样本置于15 mL再矿化液中，浸泡液每天更换1次, 37 ℃孵箱孵育10 d。取出后用去离子水（pH=7.0）冲洗吹干备用。
1．4 显微硬度测量
在脱矿处理前，用Duramin-1/-2显微硬度计（Struers A/S公司，丹麦）测量每个样本的表面显微硬度值，沿暴露面的横中线随机测量15个点，作为基准线[10]。脱矿后在基线的上方平行测定15个点，再矿化后在基线与脱矿后测定线之间平行测定15个点，记录并计算均值，用以计算各组表面显微硬度损失的百分比（percent of the surface microhardnessdemineralization，%SMHD）及各组表面显微硬度恢复的百分比（percent of the surface microhardness re-mineralization，%SMHR）。其计算的公式[11]如下：%SMHD=（基线硬度值－脱矿后的硬度值）/基线硬度值×100%；%SMHR=（再矿化后的硬度值－脱矿后的硬度值）/（基线硬度值－脱矿后的硬度值）×100%。测定条件：每个样本每次测定条件一致，均为Knoop压头，载荷100 Pa，保压15 s。
1．5 扫描电镜观察
选取15个待测样本作扫描电镜观察：5个直接用于电镜观察。另10个样本在脱矿处理后，用抗酸指甲油将暴露窗口覆盖1/2，遮盖的一端用刀片作“十”记号，作再矿化处理。每个样本观察前均放入2.5%戊二醛液内固定24 h。临界点干燥，镀金，扫描电镜下观察并采集图像，工作电压为20 kV。
1．6 透射显微镜和偏光显微镜观察
选取15颗完整无龋坏、新鲜离体氟斑牙作透射显微镜、偏光显微镜观察：5颗直接制成脱矿前的观察磨片。另外10颗脱矿处理后，用抗酸指甲油将牙唇面根1/2覆盖，作再矿化处理。每个样本制备成2张磨片，约100 μm厚，经水浸渍24 h后用偏光显微镜（ECLIPSE ME600L，Nikon公司，日本）观察。数码影像由专用软件（Nikon ACT-1 for L-1，Nikon公司，日本）获取。
1．7 统计分析
采用SPSS 11.5软件包分析实验数据。统计方法为单因素方差分析及两两比较分析。
2 结果
2．1 显微硬度值
如表1所示，脱矿前后氟斑牙的表面显微硬度明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。其表面硬度损失百分比（%SMHD）为（27.23±4.79）%。再矿化前后氟斑牙的表面显微硬度下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。其表面显微硬度恢复的百分比（%SMHR）为（52.32±4.23）%。
2．2 微观形貌
由偏光显微镜（图1）以及扫描电镜图像（图2~4）可见，脱矿后，主要表现为表层下脱矿，偏光显微镜下可见负性双折射的完整表层和表层下散在的呈正性双折射的病损区。扫描电镜下则可见病损区凹坑样缺损，边缘清晰，亮度增加。压痕断面可见釉柱晶体形态各异，排列紊乱疏松，晶体之间出现孔隙，柱间质区增宽。再矿化后，样本出现表层下再矿化带。偏光显微镜下可见磨片表层明显增厚，密度增加，病损体部出现负性双折射的再矿化带，病损深度变浅。扫描电镜下则可见釉质表面较脱矿后规则均匀，有许多大小形状不一的圆形或椭圆形晶体颗粒沉积，大颗粒由数个小颗粒组成。再矿化前的显微压痕上覆盖一层膜状的结构，高倍镜下观察，膜状结构亦由许多大小形状不一的圆形或椭圆形晶体颗粒沉积而成。
3 讨论
本实验通过酸蚀凝胶脱矿法，建立氟斑牙的早期龋的脱矿模型，以模拟其病理变化，初步探讨其病损机制。研究表明，氟斑牙脱矿后出现类似正常釉质早期龋表层下脱矿的病理改变，釉质表面显微硬度值出现明显下降。偏光显微镜下可见表层变薄，但尚未完全消失，表层下出现连续的正性双折射病损体部。扫描电镜下则可见釉质表面呈鱼鳞样，釉柱头端模糊，柱间质溶解凹陷，出现多孔隙、不规则外观，花团状氟斑病损区清晰。其脱矿的基本过程为酸扩散进入釉质，与晶格离子发生反应及反应物的溶出。由于氟斑牙含氟量较正常牙高，表层矿化异常，这可能使氟斑牙能抵抗表层的脱矿并促进表层及表层下再矿化反应，表现出基本连续表层的原因。实验结果显示，氟斑牙组与正常牙组表面显微硬度损失百分比之间的差异有统计学意义，氟斑牙表面显微硬度损失百分比小于正常牙组，表现出一定的抗酸性。但在超微结构上，氟斑病损区仍清晰可见凹坑样缺损，晶体形态各异，排列疏松紊乱，有大小不等的孔隙。这种病理改变使酸性物质较易扩散至釉质表层下，出现典型的表层下脱矿的病损区。故本实验结果提示临床仍应注意氟斑牙早期龋的预防。
本实验研究表明，通过再矿化处理后，氟斑牙脱矿的区域均出现再矿化现象，釉质表面显微硬度值出现明显升高，主要表现为表层下再矿化。偏光显微镜下可见磨片表层明显增厚，密度增加，病损体部出现负性双折射的再矿化带，病损深度变浅。扫描电镜下则可见釉质表面较脱矿后规则均匀，有许多大小形状不一的圆形或椭圆形晶体颗粒沉积，大颗粒由数个小颗粒组成。再矿化前的显微压痕上覆盖一层膜状的结构，高倍镜下观察，膜状结构亦由许多大小形状不一的圆形或椭圆形晶体颗粒沉积而成。膜样覆盖的结构使部分溶解的晶体能被来源于再矿化液中的钙磷离子沉积诱导而增长。这是釉柱晶体修复重建[12]的基础。本实验结果与楚金普等[11]在正常牙早期龋模型再矿化实验中观察到的现象类似。目前口腔内的钙磷优势与龋发生的负相关关系已经公认。在pH值中性的条件下，体积浓度为1%的CPP溶液，60 mmol/L CaCl2，36 mmol/L Na3PO4，可以稳定形成胶体样的酪蛋白磷酸肽-磷酸钙混合物（CPP-CP）。CPP-CP的防龋机制是通过稳定磷酸钙使溶液中存在高浓度的钙离子和磷酸离子。同时CPP-CP溶胶还具有缓释钙库作用，始终保持有效的游离钙、磷浓度，从而减少釉质的脱矿，增强再矿化。本实验所用的再矿化液中本身不含氟离子，氟斑牙组与正常牙组表面显微硬度恢复百分比之间的差异有统计学意义，氟斑牙表面显微硬度恢复百分比大于正常牙组，出现较明显的再矿化现象，提示氟斑牙脱矿过程中所析出的氟离子可能在再矿化的过程中被重新摄取利用，从而促进再矿化现象的出现。这对氟斑牙早期龋的预防及保守治疗有一定的临床意义。
