摘 要 目的：利用随机引物聚合酶链反应探讨血链球菌各菌种基因分型，比较它们之间的基因差异。方法：设计随机引物5′AAG AGA GGAGCT AGC TCT TCT TGG 3′，提取血链球菌标准菌株5株和临床菌株8株的染色体DNA后进行PCR扩增。结果：血链球菌各菌种扩增的基因片段有较大区别，且实验稳定性、重复性较好，可用于细菌的鉴定。结论：随机引物聚合酶链反应可用于血链球菌各菌种的鉴定和分型。
关键词 随机引物聚合酶链反应 血链球菌 分型和鉴定
Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction for the Genotypic Identification of Streptococcus Sanguis Group Deng Shuli,Chen Hui,Zhang Weidong.Affiliated Hospital of Stomatology,College of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou (310006)
Abstract:Objective:To study gene identification of Streptococcus sanguis group (SSG) strains and compare their differences by arbitrarily primed polymerase chain reaction (APPCR).Methods:APPCR DNA polymorphism technique was used to distinguish SSG strains by designing arbitrary primer 5′ AGA
GGA GCT AGC TCT TCT TGG 3′ and extracting chromosomal DNA of 13 SSG strains including model and clinical species.Results:There were great differences in the main band of polymorphism among SSG species.The experiment was steady and can be repeated.Conclusion:APPCR DNA polymorphism method can rapidly identify and classify SSG species.
Key Words:APPCR; SSG; Identification and classification
血链球菌属口腔原生菌群，与维持口腔生态平衡密切相关。它们可通过唾液获得性薄膜粘附于牙齿表面，为其它细菌提供结合位点，导致一些病理过程的发生，如龋病。一些口腔卫生和治疗措施还可引起菌血症，血链球菌就通过血液循环引起全身性疾病如感染性心内膜炎。有些学者还认为血链球菌对牙周可疑致病菌有拮抗作用，是牙周的有益菌群。并建议运用血链球菌进行牙周病的细菌治疗。根据目前分类［1］，原称血链球菌其实是由一组细菌组成：可分为口腔链球菌，缓症链球菌、高氏链球菌、血链球菌等。因此对血链球菌各菌种通过基因分型对其进行更准确地分类、鉴定，有利于为血链球菌与龋病、牙周病以及全身性疾病相关性研究提供方法。本研究旨在利用随机性引物
聚合酶链反应(arbitrarily primed polymerase chain reaction,APPCR)对血链球菌标准菌株和临床分离菌株的DNA进行扩增，根据扩增的DNA多态位点比较它们基因型差异，寻找一种可快速有效地对血链球菌各菌种进行了分型、鉴定的方法。
1 材料和方法
1.1 细菌来源
13株细菌中血链球菌的标准菌株2株，高氏链球菌标准菌株1株，口腔链球菌标准菌株1株，缓症链球菌标准菌株1株，临床分离菌株8株。其中血链球菌ATCC10556、口腔链球菌ATCC10557由华西医科大学口腔医学院赠予；血链球菌133-79由美国明尼苏达大学赠予；高氏链球菌ATCC10558、缓症链球菌购自上海第二医科大学口腔研究所。
1.2 细菌染色体DNA提取
细菌在血琼脂培养基上，微需氧环境中37℃培养24小时。收集纯化细菌加入到200 μl ddH2O中，配制成1×108的细菌悬浮液。震荡1分钟混匀，在沸水中水浴15分钟，然后离心(500 g×1 min)，提上清液(其中含血链球菌的染色体DNA)。
1.3 APPCR
引物［1］：5′AAG AGA GGA GCT AGC TCT TCT TGG 3′(上海生工公司合成)。50 μl的反应体系中［2］：TaqDNA酶2 units,10×buffer 5 μl，200 μM dNTP 1 μl,MgCl2 5 μl，引物1 μl(110 ng/μl)，模板DNA 2 μl,不足体积用ddH2O补齐。反应条件：共35个循环，前4个循环中：94℃ 5分钟，30℃ 5分钟，72℃ 5分钟；其后的30个循环中：94℃ 1分钟，30℃ 1分钟，72℃ 2分钟；最后一个循环72℃ 5分钟。取反应产物15 μl在2%琼脂糖凝胶中100 V中电泳2小时(1×TBE缓冲液)，观察并记录实验结果。
