[摘要] 目的 观察P物质对牙龈成纤维细胞内游离钙浓度的影响。方法 体外培养人牙龈成纤维细胞，以荧光探针Fluo-3／AM标记，加入P物质，激光扫描共聚焦显微镜检测人牙龈成纤维细胞内游离钙浓度的变化情况。结果 经浓度为10—7mol/L的P物质作用后，可见人牙龈成纤维细胞内游离钙浓度升高(荧光值增加)。结论 P物质能升高人牙龈成纤维细胞内游离钙离子浓度，可能在牙周炎症进程中起一定作用。
[关键词] 人牙龈成纤维细胞；游离Ca2+；P物质
神经肽P物质(substance P，SP)其神经递质及神经调质作用使其成为某些组织炎症的标志物。SP广泛分布于牙周组织中，在牙周、牙髓组织的炎症及愈合过程中起重要作用「1—4」。当外源性或内源性因素刺激感觉神经时，能引起SP向牙周组织内血管释放，导致血管舒张，毛细血管通透性增加及血浆渗出，引起神经性炎症反应，启动并调节炎症过程「4,5」。在本研究中，采用激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope，LSCM)技术，观察SP对人牙龈成纤维细胞(Singival fibroblast，GF)内游离钙水平动态变化的影响，探讨SP在牙周组织炎症过程及修复中的意义。
1 材料和方法
1．1 细胞培养
在志愿者知情同意下，对正畸拔牙的拔牙创以最小的创伤取少量牙龈组织。将取得的牙龈组织，在无菌条件下剪成l mmXI mmXl mm大小，按组织块法贴壁培养。细胞传代至第3代，待细胞爬片后采用免疫组化染色(ABC法)做细胞鉴定，波纹丝蛋白染色强阳性(鼠抗人波形丝蛋白单抗)，角蛋白染色阴性(鼠抗人角蛋白单抗)，确认为人牙龈成纤维细胞。继续培养至第4代，经胰酶消化法消化细胞，调节细胞密度为10 5／L，接种于6孔板，每孔底预置一片24 mmX24 mm盖玻片，细胞接种于盖玻片后静止30 min，使细胞贴壁，继续培养24 h，待测。
1．2 荧光染料负载细胞
PBS洗涤标本3遍，37 ℃水浴，避光条件下加入FIuo-3／AM(Fluo-3的乙酰羟甲基酯形式)(10 ul／L)荷载，30 min后PBS再洗3遍，去除细胞外残余染料，含钙PBS少量平衡10 min。将盖玻片取出，置于激光扫描共聚焦显微镜载物台上。
1．3 加药检测
P物质购自美国Sigma公司，使用前用去离子水调节其浓度为lO-4 mol／L，—20℃保存备用。用微量加样器加药液到盖玻片上，使药扩散到细胞上，使细胞外最终药液浓度为10-7 mol／L，选择贴壁良好的活细胞进行观察。
1．4 激光扫描共聚焦成像
采用ISCM510型激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss Corp，German)，对细胞加入SP前后进行动态扫描，激发波长488 nm，发射波长520 nm。对扫描得到的荧光图像进行分析，得到反映细胞内游离钙浓度在SP刺激下动态变化的曲线。
2 结 果
荧光染料负载人牙龈成纤维细胞后，采用激光扫描共聚焦显微镜对细胞进行扫描，可见细胞刺激前荧光值稳定，加入10—7 mol／L浓度的SP后，细胞荧光值发生明显变化，加药后20 s荧光值开始升高，29 s到达峰值，然后缓慢下降，回复静息水平，历时54 s。荧光值平均增加约80％(图1)。
加药后时间(S)
图l SP作用人CF后细胞内游离钙离子的浓度变化
3 讨论
SP在牙髓炎症中的作用有较多的研究，但在牙周炎症过程中的作用报道较少，同时，与牙髓组织的低适应性不同的是，牙周组织具有较强的自我调节功能，虽有研究指出SP可能与抗牙周感染有关，并在组织修复、再生中也发挥较大作用，但其确切意义并没有完全阐明「6」。
已有研究证实在正常和炎症牙龈中均有SP存在「3」，同时人成纤维细胞中存在着SP受体「7」，说明SP可能对成纤维细胞起作用。在牙周炎症早期的牙龈炎病损阶段，既有相当数量炎症性神经肽SP释放的增长，并有病损区内牙龈成纤维细胞的退变及胶原破坏。
