提 要 为探讨ET-1与口腔粘膜下纤维性变（OSF）的关系，应用免疫组化染色和图像分析技术，检测了OSF 30例、正常口腔粘膜（NOR）10例组织中ET-1的定位分布和含量。结果显示：①OSF组织中ET-1有异常表达，其免疫阳性物质主要分布于上皮棘细胞、基底细胞，间质成纤维细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞的胞浆胞膜上；②ET-1在OSF组织表达的阳性率及相对含量均显著高于NOR（P＜0.01）；③OSF各期ET-1相对含量存在差别，其中早、中期上皮细胞ET-1相对含量显著高于晚期（P＜0.05）。由此提示，ET-1可能参与了OSF的纤维化过程。
关键词 内皮素-1 口腔粘膜下纤维性变 形态计量学
内皮素-1（Endothelin-1,ET-1)是日本学者Yanagisawa于1988年首先从猪主动脉内皮细胞培养的上清液分离纯化的血管活性多肽，是迄今所知最强的缩血管因子［1］，近年来大量资料研究表明，ET-1具有促细胞生长效应，尤其能促进与纤维化有关的细胞增殖、刺激胶原合成增加而与组织纤维化关系密切［2～8］。而有关ET-1在口腔粘膜下纤维性变（oral submucous fibrosis，OSF)的表达目前国内外尚无报道。从ET-1的多重生物效应，推测可能与OSF的纤维化的形成有关。本文采用免疫组化染色和图像分析技术检测了ET-1在OSF组织，正常口腔粘膜（normal oral mucosa,NOR)的分布和含量，从而为探讨ET-1参与OSF发病机理提供客观依据。
材料与方法
1. 标本收集：所有标本均来源于湖南医科大学口腔系粘膜病专科门诊。正常对照组10例取自无槟榔、烟、酒嗜好、身体健康的自愿者相应部位的颊粘膜。病变组按Pindborg病理学标准［9］及临床表现，经病理学家确诊并分期，取OSF早、中、晚期各10例。10％福尔马林固定，常规石蜡包埋，连续切片，4～5μm分别作HE和免疫组化染色。
2. 免疫组化染色：采用美国PENISULALA-BORATORIES公司的兔抗人ET-1抗体和武汉博士德公司的SABC试剂盒进行。①切片脱蜡至水；②3％过氧化氢孵育5min；③PBS浸泡3×5min；④抗原微波修复，0.01M柠檬酸盐缓冲液（pH6.0)95±1.0℃作用2×5min，冷却，重复③；⑤10％正常羊血清封闭37℃30min；⑥1∶500 ET-1抗体，37℃温育30min，4℃冰箱内过夜，重复③；⑦1∶100生物素标记的羊抗兔IgG,37℃温育30min，重复③；⑧1∶100SABC试剂，37℃30min，重复③；⑨新鲜配制0.04％DAB-H2O2液显色，流水冲洗；⑩苏木素复染，封片。以上步骤除注明外，均在室温下进行。每批免疫组化染色中，以正常肾上腺作为阳性对照［10］，以PBS取代ET-1抗体作为阴性对照，以正常口腔粘膜为正常对照。
3. 图像分析。利用MIAS-300型图像分析系统，计量分析已做过免疫组化染色的各组织标本中ET-1相对含量。将切片置于光学显微镜下成像，高分辨摄像机CCP摄像，经计算机处理后，图像分析仪显示数字图像并存储，经图像处理后测定阳性反应物的灰度值。每例随机选择测试10个高倍视野，分别记录上皮和上皮下间质细胞的平均灰度值。平均灰度值是图像分析中用来表示图像的透光率，细胞内ET-1含量高染色深，透光率低则灰度值低，反之则越大［11］。
4. 免疫组化阳性结果判断：阳性对照中，胞浆、胞膜上可见棕黄色颗粒，阴性对照中所有组织和细胞仅为淡淡的浅黄色背景染色，说明ET-1免疫组化染色具有特异性。免疫组化染色的细胞胞浆、胞膜上出现棕黄或黄色颗粒记为阳性细胞，阳性细胞数超过待标记细胞总数50％以上者，记为阳性病例。
结 果
1. ET-1在各组口腔粘膜组织的表达分布
正常口腔粘膜，1例ET-1阳性表达，仅在上皮基底层及近基层少量棘细胞胞浆中散在染色，上皮下间质基本不着色。OSF早期，7例ET-1阳性表达，棘细胞、基底细胞胞浆胞膜上均见棕黄色染色，空泡性变的棘细胞亦见棕黄染色（图1，2），间质中成纤维细胞、血管内皮细胞胞浆胞膜亦见阳性染色，此外，血管平滑肌细胞、血管周围少量炎性细胞亦见阳性染色（图3，4）且阳性血管周围的成纤维细胞阳性反应明显。OSF中期，上皮9例ET-1阳性表达，染色范围较早期进一步扩大，棘细胞、基底细胞胞浆胞膜染色加深，间质7例阳性表达，染色强度略弱于上皮细胞。OSF晚期，上皮6例阳性表达范围及染色程度较早、中期减少，除近基层棘细胞胞膜明显深棕色外，其余细胞胞膜胞浆可见散在棕黄染色，间质细胞染色亦相应减弱。
