Ⅰ.粘性放线菌菌毛的提取和鉴定
摘要 目的:本实验旨在建立一套提取和鉴定粘性放线菌菌毛的方法。方法:采用粘性放线菌变异株5519(1+2-)和5951(1-2+)分别提取Ⅰ型菌毛和Ⅱ型菌毛。首先用机械搅动法分离菌毛与菌体,进一步用凝胶过滤柱层析提取、纯化两种菌毛,并通过电镜观察和对流免疫电泳进行初步鉴定。结果:证实分别提取到Ⅰ型菌毛和Ⅱ型菌毛。结论:两种菌毛的提取为进一步分析研究它们的生化特征和生物活性奠定了基础。
粘性放线菌(以下简称粘放菌)与龋病(尤其是根面龋)以及牙周病的发生均有关［1,2］。其致病作用的首要条件是它对宿主的粘附和定居。众多研究结果表明［3,4］,粘放菌表面的菌毛与粘放菌的粘附有关。粘放菌有两种功能及抗原性不同的菌毛:Ⅰ型菌毛和Ⅱ型菌毛。随着对粘放菌粘附机理的深入研究［5,6］,认为菌毛上存在与粘附有关的蛋白质,即粘结素。目前,对粘放菌菌毛上粘结素的结构与成分尚不清楚。为了深入研究两种菌毛的生物性能,以及菌毛上的粘结素,提取粘放菌菌毛成为研究的起点。目前,国内尚未见这方面的报道。本实验旨在建立一套提取和鉴定粘放菌菌毛的方法。
1 材料和方法
1.1 实验材料
粘放菌5519(1+2-)和5951(1-2+)由上海第二医科大学口腔医学研究所刘正教授惠赠。抗Ⅰ型菌毛和抗Ⅱ型菌毛的多克隆抗体由美国Florida大学Nesbitt教授惠赠。凝胶过滤柱Sepharose 6B由美国Sigma公司提供。
1.2 细菌的培养和收集
选用胰蛋白胨大豆琼脂(TSB)非选择性厌氧菌培养基。37℃厌氧培养(80%N2,20%CO2),经形态染色、生化鉴定及血清学鉴定符合标准后,纳入实验菌株。根据两种菌毛的生物学性能的差异,确定5519只有Ⅰ型菌毛,5951只有Ⅱ型菌毛。
将粘放菌5519、5951分别接种于TSB固体培养基上,37℃厌氧培养48小时,用0.01 mol/L PBS缓冲液(pH7.0)洗下平板上的细菌,分别离心收集两种细菌(3000 r/min,10分钟),再加入0.01 mol/L PBS缓冲液。
1.3 菌毛的分离
参照机械搅动法［7,8］分离菌毛与胞壁。在4℃冰箱内,磁力搅拌器搅拌菌悬液5分钟,4℃高速离心(12000×g,20分钟),收集上清液。将细菌沉淀按上述过程再处理1次。合并2次离心的上清液,为菌毛粗提物。
1.4 菌毛的提纯
用20%饱和硫酸铵沉淀上清液［4,9］,4℃高速离心(16000×g,30分钟),沉淀用少量0.01 mol/L PBS缓冲液溶解,并用相同的缓冲液反复透析2天,收集蛋白溶液,即为初步纯化菌毛。贮存于-20℃冰箱内备用。
预先用0.01 mol/L PBS缓冲液(pH7.0)平衡Sepharose 6 B柱。将1.5 ml初步纯化菌毛蛋白上样,用同样缓冲液洗脱(5 ml/h),收集样品(2 ml/管)。紫外线分光光度计测定每管OD280 nm值,计算机绘制洗脱图谱。合并电镜观察到含有菌毛的组分,即为部份纯化菌毛。冷冻干燥。
将部份纯化菌毛溶于1.0 ml缓冲液中,再次上样,按上述方法经Sepharose 6 B柱层析进一步分离纯化。
1.5 菌毛的鉴定
1.5.1 电镜观察 参照Clark等、刘正等［10,11］介绍的方法观察菌毛在处理前后的细菌表面及不同阶段提取物中存在与否。
1.5.2 免疫学鉴定 采用对流免疫电泳法鉴定。抗原为Ⅰ型或Ⅱ型菌毛的粗提物、部份纯化菌毛和纯化菌毛。抗体为抗Ⅰ型菌毛或抗Ⅱ型菌毛的多克隆抗体。
2 结 果
2.1 菌毛的提取结果
粘放菌5519、5951培养48小时后,电镜观察可见菌体表面有长短不一的菌毛(图1)。机械搅动2次后,菌体表面菌毛基本消失,菌体完整(图2)。说明本实验采用的方法使菌毛与菌体间有最大程度的分离。
图1 粘性放线菌菌体表面有长短不一的菌毛
a.粘放菌5519 EM ×60000
b.粘放菌5951 EM ×25000
图2 粘放菌机械搅动后菌体表面菌毛消失，菌体完整
a.粘放菌5519 EM ×40000
b.粘放菌5951 EM ×40000
粘放菌5519的菌毛粗提物FI经Sepharose6B第1次柱层析分离得到2个洗脱峰(图3),电镜观察到第1个峰F(I,1)有菌毛;粘放菌5951的菌毛粗提物FⅡ经柱层析也有2个洗脱峰(图4),第1个峰F(Ⅱ,1)有菌毛。
