【摘 要】 目的:克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白 C基因(gbpC) 编码序列的特异片段。方法:根据文 献报道的gbpC序列设计并合成一对 寡核苷酸引物,PCR扩增位于gbpC编码序列1105~1554bp间的一段特异片段,扩增产物经 回收、酶切后,定向插入克隆载体puc18中,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性 克隆,鉴定后进行序列测定。结果:测序结果与Sato等报道的序列 一致。结论:成功克隆了gbpC基因片段,为进一步的研究(探针标 记、杂交及表达等)奠定了基础。
【关键词】 变形链球菌; 葡聚糖结合蛋白; 聚合酶链式反应; 分子克隆; 序列测定
近年来,以免疫防龋、生态防龋为远期目标,针对变形链球菌的表面 蛋白、产物等进 行的研究方兴未艾。其最终目的,均是为上述的防龋策略寻找合适的靶物质。基于在粘附、 聚集及菌斑形成中的重要作用,一个时期以来一直被忽视的葡聚糖结合蛋白(Glucan-bindi ng proteins,Gbps)逐渐引起学者们的重视。由Sato等于1997年通过随机突变法(Random m utagenesis )发现的gbpC,可使变形链球菌在一定浓度抗生素中仍具有粘附、聚集能力, 这是一个很有意义的现象,值得进一步探讨[1]。本研究采用PCR方法,以变形链球 菌OMZ175 (S.mutans OMZ175)的基因组DNA作为模板,PCR扩增了gbpC编码区部分特异性序列并将其 克隆至puc18中,从而为后续的研究(探针标记、杂交及表达等)打下基础。
1 材料和方法
1.1 变形链球菌的培养及基因组DNA提取[2,3]
变形链球菌国际参考株S.mutans OMZ175(serotype f)厌氧培养至饱和状态, SDS+CTAB法裂 菌,酚/氯仿法提取基因组DNA。
1.2 引物设计与合成
根据Sato等(1997)报道的变形链球菌临床分离株S.mutans 109cS的gbpC序列,设计一对引 物,扩增编码序列1105~1554p间约0.45kb的特异片段,P1:5\'GCGAATTCGTTAAAATACCGG3’ ,P2:5\'ATGAGGATCCTCTGGTGTTT3\',经电脑软件(PC-Gene及Blast)检验,符合要求。由Ta KaRa公司大连分部合成。
1.3 PCR反应
在200μl PCR反应专用管中依次加入10×PCR 缓冲液5μl, dNTPs(每种浓度10mmol/ L)1μl, P1(100mmol/L)1μl,P2(100mmol/L)1μl, 基因组DNA 10μl,加无菌去离子水至50 μl,稍离心混匀。沸水中煮沸变性10min,取出迅速置冰水中,加入Taq DNA polymerase 0.5 μl,置Eppendorf Gradient PCR仪中,按以下程序进行扩增反应:94℃ 4min;94℃ 30s, 55℃ 30s,72℃ 1.5min,5循环;94℃ 30s,68℃ 1.5min,30循环;72℃ 10min。
1.4 PCR反应产物的回收
PCR反应产物用AdvantageTM PCR-Pure Kit(Clontech Labratories Inc.USA)回收(步 骤从略)。
1.5 载体的制备
将含puc18的DH5α 菌划线接种至LB琼脂平板上(含Amp100mg/L), 37℃培养过夜;取单 菌落接种于5ml LB培养基中(含Amp100mg/L), 37℃,160r/min,震荡培养过夜。 取3ml菌液离心沉淀,常规碱裂解法提取质粒[5]。
1.6 连接反应
酶切反应:①PCR反应产物16.5μl,10×3号缓冲液 2μl,EcoRI、BamHI(华美公司)各0. 75μl;稍离心混匀,37℃水浴 2h; AdvantageTM PCR-Pure Kit回收(溶于20μl pH 8.0的TE中);②puc18 16.5μl,10×3号缓冲液2μl,EcoRI 1.5μl;稍离心混匀 ,37℃水浴 2h ;增容至100μl,等体积的酚、酚/氯仿各抽提1次;2倍体积无水乙醇沉淀,700ml/L乙醇洗 涤; 晾干后溶于8μl TE(pH8.0)中;加入10×3号缓冲液 1μl,BamHI 1μl;稍离心混 匀,37℃水浴2h; AdvantageTM PCR-Pure Kit回收(溶于20μl pH8.0的TE中)。
连接反应体系: PCR反应产物5.5μl,线性化载体1.5μl,5×T4 DNA Ligase 缓冲液2μl,T4 DNA Ligase 1μl,稍离心混匀;置16℃水浴中反应16h;70℃,5 min灭活 T4 DNA Ligase,-20℃贮存备用。