摘要 目的：研究所制备的单抗与其相应的非变性抗原PAg的反应，并直观显示PAg在茸毛链球菌原位的分布。方法：采用间接免疫金标技术，通过透射电镜观察，并设置多抗以及变形链球菌和鼠链球菌作为对照。结果：抗PAg的单抗可与茸毛链球菌发生反应，与变形链球菌反应不明确，与鼠链球菌不发生反应。结论：所制备的单抗能与PAg特异性结合，PAg可能与茸毛链球菌表面茸毛层相关。
关键词 单克隆抗体 表面蛋白抗原 茸毛链球菌
在口腔链球菌及变形链球菌组细菌表面均存在主要表面蛋白或其类似物，迄今为止，已从变形链球菌组血清型a、c、d、e、f、g菌株中分离。基因序列分析表明不同菌种间的主要表面蛋白具有同源性，它们可能在细菌对牙面的粘附及细菌间的聚集过程中发挥作用[1,2]。
为了进一步研究变形链球菌组细胞主要表面蛋白抗原的结构和功能，制备了抗茸毛链球菌6715（S.sobrinus，血清g型）主要表面蛋白（PAg）的单克隆 抗体（简称单抗），通过免疫电镜技术用金标颗粒直观显示单抗与原位PAg的反应，以对PAg进行超微定位。同时设置了抗PAg多克隆抗体（简称多抗）、抗茸毛链球菌6715全细胞多抗以及变形链球菌Ingbritt C (S.mutans, 血清C型)、鼠链球菌BHT（S.rattus，血清b型）作对照。
材料和方法
1． 细菌：茸毛链球菌6715国际标准株，变形链球菌Ingbritt C，由湖北医科大学口腔医学院实验中心提供；鼠链球菌BHT，由北京药品生物制品检定所提供。
2． 培养基：轻唾琼脂培养基（MSA, DEFCO），牛心脑浸液培养基（BHI, GIBCO）。
3． 抗体：①抗PAg单抗：采用经典的单抗制备法，即将茸毛链球菌6715活细胞免疫的BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0-AG14融合，ELISA筛选，有限稀释法克隆化，得到稳定分泌抗PAg的杂交瘤细胞株ZS2/286, 所致小鼠腹水单抗用辛酸—硫酸铵沉淀法纯化。经免疫双扩鉴定为IgG1亚类单抗，Western-blotting 显示其在PAg相应位置呈单一条带。②兔抗PAg抗血清由Dr. Toshihiko Koga（Kyushu University, Japan）惠赠。③兔抗茸毛链球菌6715全细胞抗血清：将灭活6715经兔耳静脉注射，每周2～3次，共5周。末次注射8d后采血，免疫双扩鉴定其特异性。④10nm胶体金标记羊抗小鼠IgG，10nm胶体金标记羊抗兔IgG（武汉博士德生物工程公司）。
4． 免疫电镜：分别接种各菌株于MSA平皿，培养48h后挑典型单菌落于BHI中培养18h，菌液离心，沉淀细胞用PBS洗涤并悬浮。取20μl菌液加于Formvar包被的镍网上，室温孵育10min并干燥。3%BSA/PBS封闭60min。洗涤后加一抗孵育60min，阴性对照为小鼠非特异性腹水。洗涤后分别加二抗孵育60min。充分洗涤，4℃过夜干燥，2%磷钨酸染色2min, TEM（Hitachi H-600型）观察。
结 果
1． 抗6715全细胞多抗与各菌株的作用： 由图1, 2, 3可见， 抗茸毛链球菌6715全细胞多抗与6715、变形链球菌Ingbritt C和鼠链球菌BHT均有不同程度的反应。
2． 抗PAg多抗与各菌株的作用：由图4, 5, 6可见，抗PAg多抗除可与茸毛链球菌6715发生明显反应外，与变形链球菌Ingbritt C也存在明显交叉反应。但未见抗PAg多抗与鼠链球菌BHT发生反应。
3． 抗PAg单抗与各菌株的作用：抗PAg单抗ZS2/286可与6715发生反应，且金标颗粒均位于完整的细胞外层表面，但与多抗相比，结合的金标颗粒较少（图7）。Ingbritt C与抗PAg单抗反应不明确或较微弱（图8）。BHT与抗PAg单抗不发生反应（图9）。
4． 6715阴性对照细胞表面未见金标颗粒存在（图10）。
图1 抗6715全细胞多抗+S.sobrinus 6715
图2 抗6715全细胞多抗+S.mutans Ingbritt C
图3 抗6715全细胞多抗+S.rattus BHT
图4 抗PAg多抗+S.sobrinus 6715
图5 抗PAg多抗+S.mutans Ingbritt C
图6 抗PAg多抗+S.rattus BHT
图7 单抗ZS2/286+S.sobrinus 6715
