Ⅱ.粘性放线菌菌毛化学组成的分析
摘要 目的:了解采用机械搅拌法提取的粘性放线菌Ⅰ型、Ⅱ型两种菌毛的化学组成。方法:首先制备出抗Ⅰ型菌毛抗血清和抗Ⅱ型菌毛抗血清,鉴定两种菌毛纯化物纯度后,采用考马斯亮蓝法和蒽酮法分别测定两种菌毛中蛋白质和糖的含量,并进行氨基酸组成分析。结果:两种菌毛的主要成分是蛋白质,糖含量较低。两种菌毛均是天门冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、赖氨酸和甘氨酸含量较多。两种菌毛中,非极性氨基酸百分含量最高,碱性氨基酸百分含量最低。结论:本实验结果有助于了解两种菌毛的化学组成与其生物性能的关系。
关键词 粘性放线菌菌毛 化学组成 氨基酸组成
粘性放线菌(简称粘放菌)菌毛是粘放菌的一个形态特征和结构组成部分。由于在粘放菌粘附中的重要作用,粘放菌菌毛受到广泛的重视和研究。对粘放菌菌毛的研究,包括形态、抗原性和功能等方面的研究。而对粘放菌菌毛化学组成的研究是认识菌毛的物质基础。本实验用兔抗Ⅰ型菌毛抗体和兔抗Ⅱ型菌毛抗体对所提取纯化的Ⅰ型菌毛和Ⅱ型菌毛作初步免疫纯度鉴定后,分别了解Ⅰ型菌毛和Ⅱ型菌毛的化学组成及氨基酸组成。
1 材料和方法
1.1 材料
雄性日本大耳白兔(华西医科大学动物实验中心提供),粘放菌5519(1+2-)和5951(1-2+)由上海第二医科大学口腔医学研究所刘正教授惠赠,牛血清白蛋白(美国Sigma公司)。835-50型氨基酸自动分析仪(日本日立公司)。
1.2 抗体的制备
1.2.1 抗原的制备 按参考文献［1］的方法,得到第一次柱层析后部分纯化的Ⅰ型菌毛F(Ⅰ,1)和Ⅱ型菌毛F(Ⅱ,1)。取上述两种冻干蛋白质分别溶解于少量无菌蒸馏水,调节蛋白浓度为2 mg/ml(考马斯亮蓝法),4℃贮存备用。
1.2.2 兔抗血清的制备 首次免疫,采用部分纯化的F(Ⅰ,1)和F(Ⅱ,1)作为抗原与弗氏完全佐剂混合,兔的足趾多点皮下注射。14天后,抗原加弗氏不完全佐剂,兔四肢多点皮下注射。14天后,兔耳静脉注射。10天后心脏采血,分别收集血清,双向免疫扩散法测抗血清效价,并检测抗血清与抗原间有无交叉免疫反应。抗血清-20℃贮存备用。
1.2.3 抗Ⅰ型菌毛抗血清和抗Ⅱ型菌毛抗血清的制备 参照Clark等［2～5］介绍的免疫吸附法进行。将抗F(Ⅰ,1)的抗血清与粘放菌5951菌体混合,抗F(Ⅱ,1)的抗血清与粘放菌5519菌体混合,离心(10000×g,10 min)收集上清液。重复上述处理过程多次,直至用双向免疫扩散法检测到无交叉免疫沉淀反应出现。分别收集吸附过的抗血清,即为抗Ⅰ型菌毛抗血清和抗Ⅱ型菌毛抗血清。
1.3 两种菌毛纯化物的免疫纯度鉴定
采用4种兔抗血清:未经免疫吸附的两种兔抗血清,经免疫吸附的抗Ⅰ型菌毛抗血清和抗Ⅱ型菌毛抗血清。Ⅰ型菌毛纯化物F(Ⅰ,1,1)和Ⅱ型菌毛纯化物F(Ⅱ,1,1)的制备［1］。
参照免疫电泳法,确定Ⅰ型菌毛F(Ⅰ,1,1)和Ⅱ型菌毛F(Ⅱ,1,1)的免疫纯度。
1.4 两种菌毛化学组成分析
1.4.1 菌毛待测样品的配制 分别称取冰冻干燥的Ⅰ型菌毛F(Ⅰ,1,1)和Ⅱ型菌毛F(Ⅱ,1,1),溶于蒸馏水,配制成0.5 mg/ml的待测样品溶液,4℃冰箱内贮存,备用。
1.4.2 菌毛的蛋白质含量测定 以牛血清白蛋白为标准,采用考马斯亮蓝法测定。
1.4.3 菌毛的糖含量测定 以葡萄糖为标准,采用蒽酮法测定。
1.4.4 菌毛的氨基酸组成分析 将两种菌毛样品分别溶于6 mol/L HCl中,真空条件下,110℃水解24小时,氨基酸自动分析仪检测菌毛蛋白质的氨基酸组成。
2 结 果
2.1 兔抗Ⅰ型菌毛和抗Ⅱ型菌毛抗血清的制备结果
用部分纯化的F(Ⅰ,1)和F(Ⅱ,1)为抗原分别制备两种兔抗血清,双向免疫扩散法测定效价及交叉免疫反应结果见图1。由图1可见:抗F(Ⅰ,1)的兔抗血清效价为1∶8,抗F(Ⅱ,1)的兔抗血清效价为1∶4。同时发现两种抗原与两种抗血清间有交叉反应,说明两种抗部分纯化菌毛的兔抗血清不是特异性的抗Ⅰ型菌毛或抗Ⅱ型菌毛抗血清。
