摘要 目的:探讨血链球菌特异DNA片段探针制备及临床应用。方法:采用特异引物的PCR扩增及运用探针进行Southern杂交,斑点杂交来检测口腔链球菌同源序列。结果:S34sr,S34非1和ATCC10556的DNA含有同源序列,另有两株血链球菌临床分离株斑点杂交结果为弱阳性,其它30余株细胞杂交结果阳性。结论:血链球菌ATCC10556菌株中的nif基因为血链球菌的特异基因,该基因在血链球菌蛋白的表达及功能尚待深入探讨。
关键词 血链球菌 地高辛探针 nif基因
以往的研究表明血链球菌S.sr DNA重组质粒PCRTM3-S.sr含有nif基因［1］。nif基因在血链球菌的能量代谢及蛋白功能的具体作用及与口腔疾病的发生相关因素仍未完全明确,血链球菌ATCC10556所含有的nif基因是否也存在于其它菌群未见报道。本研究根据已知序列,设计特异引物及标记的DIG探针再次验证nif的基因是否存在于血链球菌ATCC10556菌株中;另一方面检测口腔链球菌及其它菌群中是否也含有nif基因。
1 材料和方法
1.1 菌种选择
血链球菌:ATCC10556,S34sr,S34非1,JFr及临床分离株;变链球菌:国际参考株血清型c、d、f及临床分离株;唾液链球菌:HHT模式株;其它菌种:大肠杆菌、绿脓杆菌、阴沟杆菌、产气荚膜杆菌、葡萄球菌、奈瑟代菌等共30余种细菌。
1.2 引物设计
通过oligonucleotide二级结构检测,根据测序的800 bp DNA片段设计一对引物。上游引物:5\'TAGTTGAAGCGA TTAAAGCG3\',下游引物:5\'TCGTCGTGAAAGCC AAA3\'。
1.3 实验方法
1.3.1 DNA提取
常规方法 经碘酚和氯仿,氯仿和异戊醇抽提细菌染色体DNA。
煮沸法 过夜培养细菌,收集菌体,溶菌酶,1%SDS及蛋白酶K,65℃水浴1小时;加入自配的DNA裂解液混匀水浴60℃1小时;沸水煮沸10分,12000 r/min离心5分,收集上清液即含有细菌染色体DNA。
1.3.2 PCR扩增
以细菌DNA为模板,用设计的特异一对引物进行PCR扩增。反应条件为95℃变性3分,95℃1分,55℃50秒,72℃1.5分,72℃延伸5分,40个循环。
1.3.3 地高辛(DIG)标记探针制备
DIG探针标记 ATCC10556 PCR S.sr质粒酶切产物加入双蒸水16 μl,100℃加热5分使DNA变性,加入DIG标记引物4 μl 20小时孵育,标记后用0.2 mμ的EDTA终止反应。
探针浓度测定 标记的产物1 μl加入到39 μl DNA稀释液中,倍比稀释,点样定量测定显示1∶33稀释浓度的探针做杂交实验较为适宜。
1.3.4 Southern印迹、斑点印迹和Southern杂交及检测
细菌DNA PCR扩增产物进行1%琼脂糖电泳检测,将凝胶变性后印迹于尼龙膜,DNA转移24小时,80℃2小时真空干燥尼龙膜;斑点印迹为细菌提取的染色体DNA 5 μl沸水煮沸10分变性,点样于尼龙膜,将尼龙膜80℃真空干燥2小时。
将尼龙膜放入含有变性探针的杂交液2.5 ml中杂交,68℃16小时,洗膜,加入二抗,最后加入10 ml新鲜配制的底物显色。
2 结 果
2.1 特异引物PCR扩增
根据引物设计预计扩增出559个碱基,在设计的PCR扩增条件下,电泳仅出现一条特异带并与预计长度相符。结果显示血链球菌ATCC10556及S34sr扩出同样片段,而且血链球菌JFr菌株、变链球菌、唾液链球菌、大肠杆菌等非亲源性细菌未扩出相应DNA片段(图1)。
图1 特异引物PCR扩增结果 A：ATCC10556，B：S34sr，C：JFr，D：变链球菌血清型c，E：变链球菌血清型f，G、H：血链球菌临床分离株
2.2 细菌DNA提取的改进
采用自配的细菌裂解液提取细菌DNA使检测方法更为容易和简单。采用同样PCR扩增条件,ATCC10556扩出同等特异片段,而其它细菌未扩出同样DNA片段,显示煮沸后提取的DNA足够PCR扩增需要(图2)。
图2 采用不同DNA提取方法特异引物PCR扩增结果 B：煮沸提取，C：经典提取
2.3 Southern杂交
Southern印迹杂交显示800 bp左右DNA基因片段含有ATCC10556S.sr基因,即nif基因(图3)。斑点杂交表明,血链球菌国际参考株S34sr,S34非1同样含有nif基因,其中血链球菌2株临床分离株为弱阳性。阴性对照及变链球菌、唾液链球菌、革兰氏阴性杆菌、产气杆菌、葡萄球菌等菌株杂交阴性,表明不含有nif基因(图4)。
